质粒DNA提取及纯化
6页1、质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测一、实验目的1 掌握质粒 DNA 的制备的原理和方法2 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1 质粒 DNA 的制备方法质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双 链 DNA 分子, 分布于细菌、 放线菌、 真菌以及一些动植物细胞中, 但在细 菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1200Kb之间,是应用最多的质粒 类群,在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。质粒 DNA的制备包括3个步骤:培养细菌,使质粒DNA大量扩增;收集 和裂解细菌; 分离和纯化质粒 DNA。 主要方法包括: 碱裂解法: 0.2molNaOH+1%SDS; 煮沸裂解法: 沸水煮沸 40 秒; SDS 裂解法: 10%SDS, 一般用于质粒大量提取。 在实际操作中可以根据宿主菌株类型、 质 粒分子大小、 碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。 本实验 选择碱裂解法提取质粒 DNA。2 碱裂解法质粒 DNA 具特定的形态结构, 在特殊的环境条件下, 如加热、 极端 pH 值、 有机溶剂、尿素、 酰胺试剂等会导致质
2、粒 DNA 变性, 去除变性条件又可以使DNA 复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒 DNA 和线性染色体 DNA 在拓 扑学上的差异来分离质粒DNA。SDS是一种阴离子表面活性剂,它既能裂解 细菌细胞, 又能使细菌蛋白质变性。 SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破 裂, 从而使质粒 DNA 及细菌基因组 DNA 从细胞中同时释放出来。 细菌环 状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子,在pH值介于12.0 12.5 这个狭窄的范围内, 线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性, 尽管在这 样的条件下, 共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂, 但两条互补链彼此相互盘 绕结合在一起。 当加入 pH4.8 乙酸钾缓冲液时, pH 恢复至中性, 因为共价 闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而 线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开, 复性就不会那么迅速而准 确, 它们相互缠绕形成不溶性网状结构, 而复性的质粒 DNA 恢复原来构型, 保持可溶性状态。通过离心,就可去除染色体DNA和蛋白质-SDS复合物等 物质,最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质
3、粒DNA,乙醇或异丙醇沉淀就可 得到纯的质粒 DNA, 之后可再用超离心、 电泳、 离子交换柱层析等方法进一 步纯化质粒。3 质粒琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳技术(agarose gel electrophoresis)是分离、鉴定和提纯 DNA 片断的有效方法。 琼脂糖凝胶可分辩 0.16.0kb 的双链 DNA 片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于 等电点的 pH 溶液中带负电荷, 在电场中向正极移动。 由于糖-磷酸骨架在结 构上的重复性质, 相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的静电荷, 因此它们能 以同样的速度向正极方向移动。 在一定的电场强度下, DNA 分子的迁移速 度取决于分子筛效应, 即 DNA 分子本身的大小和构型。 具有不同的相对分子 质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速度与相 对分子质量的对数值成反比关系。 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA ,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子,如pUC19 质粒, 有 3 种构型: 超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalent
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