质粒DNA提取及纯化

质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测一、实验目的1 掌握质粒 DNA 的制备的原理和方法2 了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1 质粒 DNA 的制备方法质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双 链 DNA 分子， 分布于细菌、 放线菌、 真菌以及一些动植物细胞中， 但在细 菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1200Kb之间，是应用最多的质粒 类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。质粒 DNA的制备包括3个步骤：培养细菌，使质粒DNA大量扩增；收集 和裂解细菌； 分离和纯化质粒 DNA。 主要方法包括： 碱裂解法： 0.2molNaOH+1%SDS； 煮沸裂解法： 沸水煮沸 40 秒； SDS 裂解法： 10%SDS， 一般用于质粒大量提取。 在实际操作中可以根据宿主菌株类型、 质 粒分子大小、 碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。 本实验 选择碱裂解法提取质粒 DNA。2 碱裂解法质粒 DNA 具特定的形态结构， 在特殊的环境条件下， 如加热、 极端 pH 值、 有机溶剂、尿素、 酰胺试剂等会导致质粒 DNA 变性， 去除变性条件又可以使DNA 复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒 DNA 和线性染色体 DNA 在拓 扑学上的差异来分离质粒DNA。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解 细菌细胞， 又能使细菌蛋白质变性。 SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破 裂， 从而使质粒 DNA 及细菌基因组 DNA 从细胞中同时释放出来。 细菌环 状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分子，在pH值介于12.0 12.5 这个狭窄的范围内， 线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性， 尽管在这 样的条件下， 共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂， 但两条互补链彼此相互盘 绕结合在一起。 当加入 pH4.8 乙酸钾缓冲液时， pH 恢复至中性， 因为共价 闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而 线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开， 复性就不会那么迅速而准 确， 它们相互缠绕形成不溶性网状结构， 而复性的质粒 DNA 恢复原来构型， 保持可溶性状态。通过离心，就可去除染色体DNA和蛋白质-SDS复合物等 物质，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA，乙醇或异丙醇沉淀就可 得到纯的质粒 DNA， 之后可再用超离心、 电泳、 离子交换柱层析等方法进一 步纯化质粒。3 质粒琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳技术(agarose gel electrophoresis)是分离、鉴定和提纯 DNA 片断的有效方法。 琼脂糖凝胶可分辩 0.16.0kb 的双链 DNA 片段。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子的高于 等电点的 pH 溶液中带负电荷， 在电场中向正极移动。 由于糖-磷酸骨架在结 构上的重复性质， 相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的静电荷， 因此它们能 以同样的速度向正极方向移动。 在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速 度取决于分子筛效应， 即 DNA 分子本身的大小和构型。 具有不同的相对分子 质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相 对分子质量的对数值成反比关系。 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA ,也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，如pUC19 质粒， 有 3 种构型： 超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)； 开环质粒 DNA， 即共价闭合环状质粒 DNA 1 条链断裂(open circular DNA , OCDNA)和线状质粒DNA，即共价闭合环状 质粒DNA2条链发生断裂(linear DNA, LDNA)。这3种构型的质粒DNA 分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈 3 条带， 超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。三、仪器及试剂1 仪器及耗材：冷冻离心机、微量移液器、1.5ml EP管、枪头、凝胶槽、 电泳仪等。2 试剂及配制：溶液 I ( GET 缓冲液)：25 mmol/LTris-HC( pH8.0 ) , 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖， pH8.0溶液 11(变性液)：200 mmol/L NaOH , 1% SDS 配制：1 ml10% SDS 50 pl、1N NaOH 200 pl取以上溶液， 用灭菌去离子水定容至 1ml， 充分混匀， 现用现配。溶液III (醋酸钾液):3 mol/L醋酸钾(KAc )缓冲液，pH 5.6。5 mol/L冰 醋酸配制：100 ml 醋酸钾29.4g、冰醋酸11.5 ml加入 60 ml 去离子水后搅拌溶解。 待醋酸钾溶解后， 再加去离子水将溶液定 容至100 ml。高温高压灭菌后，4°C保存。其它试剂：TE(pH8.0)、饱和酚、酚/氯仿(25 : 24)、无水乙醇、70%乙醇、 电泳缓冲液、6x上样缓冲液四、实验步骤I 接种细菌于LB液体培养基中，37工培养过夜（E coli. Top10, pUC19质粒）；2 取细菌悬液 1mL 于 1.5mLEP 管中， 4000 rpm/min， 离心 2min；3.弃上清，加入100Ml溶液I ；4 .加入200pl溶液II ,颠倒混匀，静置2min ；5 .加入150pl溶液III,颠倒混匀，静置5min ；6 . 4°C, 12000 rpm/min ,离心 10min ;7 .取400pl上清移入另一EP管，加等体积饱和酚，振荡混匀，12000 rpm/min , 离心 10min ;8 .取约300pl上层水相移入另一EP管，加等体积酚/氯仿，振荡混匀， 12000 rpm/min，离心 10min ;9 .取200pl上层水相移入另一EP管，加2倍体积无水乙醇，混匀置-201.5 C 小时， 沉淀 DNA；10 . 12000 rpm/min ,离心10min ,弃上清，加入1mL70%乙醇洗涤DNA 沉淀， 小心吸弃乙醇；II .开盖放置5 min干燥DNA ,加入15pl TE溶解DNA ；12 .加入3pl 6x上样缓冲液，混匀，18pl分两次上样于1%琼脂糖凝胶电 泳；13 .上样 9pl DNA marker。14 150V, 60min， 紫外灯下观察结果。五、结果与讨论1 质粒电泳结果质粒 DNA 在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳中， 被染成橘黄色。 如下图所 示， 质粒 DNA 可以观察到 3 条带， 电泳速度最慢的条带显色最浅。 质粒DNA有3种构型，即共价闭合环状质粒(cccDNA)、开环质粒(OCDNA)和 线状质粒DNA (LDNA)。在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3条 带， 超螺旋质粒 DNA 泳动最快， 其次为线状 DNA， 最慢的为开环质粒 DNA。本次实验的结果中的三条带，也可推测为：超螺旋质粒DNA、线状DNA和开环质粒2 .细菌基因组DNA与质粒DNA分离注意事项 在加入细菌裂解液后，需要颠倒混匀，细菌环状基因组 DNA 在操作过程中会断裂成线状DNA分子。这时应当上下颠倒轻轻混匀，以避免产生小分子量的 基因组DNA片断，最后污染提取的质粒DNA。3 溴酚蓝指示剂上样缓冲液中含有溴酚蓝（Bromophenol blue，别名四溴苯酚磺酞，最大吸收波长 422nm ），以 0.25%溴酚蓝作为电泳指示剂。溴酚蓝结构式如下图，分子式C 19 H 10 Br 4 O 5 S分子量669.96，氨基酸的平均分子量110 Da， 每对核苷酸的平均分子量是 659Da， 电泳时溴酚蓝会跑在前面， 在到达凝胶