人乳头瘤病毒（HPV）分型检测试剂盒（微阵列芯片法）

产品货号：340010 人乳头瘤病毒（HPV）分型检测试剂盒（微阵列芯片法）说明书 （微阵列芯片法） 【产品名称】 通用名称：人乳头瘤病毒（HPV）分型检测试剂盒（微阵列芯片法） 【包装规格】 24人份/套、96人份/套 【预期用途】 本试剂盒用于对人宫颈上皮细胞中人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）型别进行检测，可检测的型别包括：6、11、16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、81、82。 本产品检测结果可以辅助临床诊断，也可用于流行病学调查等领域。 【检验原理】 本试剂盒针对常见的HPV病毒型，采用多重不对称PCR结合通用芯片（Tag array）的技术对常见的HPV病毒进行检测和分型。 本试剂盒以人乳头瘤病毒基因组DNA为模板，采用带有Tag（标签）序列的型特异性引物，对各型人乳头瘤病毒基因组中L1区片段进行扩增和荧光标记，然后与能够识别编码各基因位点的相应标签序列的微阵列芯片进行杂交，最后通过人乳头瘤病毒分型检测判别系统对芯片进行扫描和数据分析就可以得到所检测的22个型的检测结果。 【主要组成成分】 表1. 试剂盒组成（24人份/套，产品货号：340010-01） 组成 种类 名称 主要成分 A部分 杂交耗材 芯片及盖片 芯片及盖片 B部分 PCR试剂 PCR扩增试剂A 扩增引物、Taq酶、dNTP、dUTP、UNG PCR扩增试剂B 扩增引物、Taq酶、dNTP、dUTP、UNG 阳性对照品 阳性对照品 HPV18型病毒克隆质粒、人基因组DNA 杂交试剂 杂交缓冲液 Denhardt’s，SDS、SSC 表2. 试剂盒组成（96人份/套，产品货号：340010-02） 组成 种类 名称 主要成分 A部分 杂交耗材 芯片及盖片 芯片及盖片 B部分 PCR试剂 PCR扩增试剂A 扩增引物、Taq酶、dNTP、dUTP、UNG PCR扩增试剂B 扩增引物、Taq酶、dNTP、dUTP、UNG 阳性对照品 阳性对照品 HPV18型病毒克隆质粒、人基因组DNA 杂交试剂 杂交缓冲液 Denhardt’s，SDS、SSC 注：不同批号试剂盒中各组分不可以互换。 主要组分-芯片介绍： 采用微量点样技术，将各位点检测探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，检测探针各重复3个点，质控探针各重复3、6个点，形成10行×9列的微阵列。每张芯片上有4个或8个同样的子阵列，每一个子阵列可以检测一份样品。子阵列中的探针排布如表3所示，排布说明见表4。 表3. 子阵列芯片探针排布（排布说明见表5） 列 行 1-3 4-6 7-9 1 QC BC PC 2 HPV16 HPV18 HPV26 3 HPV31 HPV33 HPV35 4 HPV39 HPV45 HPV51 5 HPV52 HPV53 HPV56 6 HPV58 HPV59 HPV66 7 HPV68 HPV73 HPV82 8 HPV6 HPV11 HPV70 9 HPV81 IC NC 10 PC BC QC 表4. 探针排布说明 探针种类 探针名称 探针含义 探针名称 探针含义 质控探针 QC 表面化学质控探针 BC 空白对照探针 PC 杂交阳性对照探针 NC 阴性对照探针 IC 人基因组DNA检测探针 HPV病毒型检测探针 6 HPV 6型检测探针 52 HPV 52型检测探针 11 HPV 11型检测探针 53 HPV 53型检测探针 16 HPV 16型检测探针 56 HPV 56型检测探针 18 HPV 18型检测探针 58 HPV 58型检测探针 26 HPV 26型检测探针 59 HPV 59型检测探针 31 HPV 31型检测探针 66 HPV 66型检测探针 33 HPV 33型检测探针 68 HPV 68型检测探针 35 HPV 35型检测探针 70 HPV 70型检测探针 39 HPV 39型检测探针 73 HPV 73型检测探针 45 HPV 45型检测探针 81 HPV 81型检测探针 51 HPV 51型检测探针 82 HPV 82型检测探针 【储存条件及有效期】 试剂盒A部分于2～8℃避光保存，有效期为8个月；试剂盒B部分于-20℃避光保存，有效期为8个月。 拆封后的芯片室温避光保存，建议一月之内用完。 【适用仪器】 博奥生物LuxScan™ 10K-A/B微阵列芯片扫描仪。 【样本要求】 1.样本 临床上常用方法采集的宫颈脱落细胞样本。 2.采集方法 按照临床样本采集标准操作流程进行，样本应避免经期采集；采集后的样本放于样本保存液中。 3.保存 采集的样本应立即送检，若不能立即检测， 2～8℃保存不超过一周；-20℃保存不应超过三个月；样本应避免反复冻融。 4.运输 样本的短期运输可采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。 【检验方法】 注：试剂盒从PCR扩增开始，样品制备过程推荐使用博奥生物核酸提取试剂，产品货号：340011。 整个检测过程需要自备以下试剂： l 纯化水 l 10% SDS（推荐使用博奥生物的清洗液，产品货号：441060） l 20×SSC（推荐使用博奥生物的清洗液，产品货号：441050） 1. PCR扩增 1.1 实验前准备 l 纯化水 l 待检样品DNA 1.2 分装PCR反应体系 在PCR配液区内，按照被检样品数目的两倍（两套管分别用来检测HPV的不同型）准备200 μL离心管，并在管上标记样品编号，两套管须一一对应。从试剂盒中取出PCR扩增试剂A和扩增试剂B，使其充分融化（自然解冻），涡旋混匀，瞬时离心至管底。 建议：每次PCR扩增时，可增加2个PCR反应体系，其中之一加入1 μL阳性对照品（红色盖），用于PCR扩增和杂交过程的质控；同时，另一管做以纯化水为模板的BC对照，以监控环境及操作过程中的污染情况。该操作需要增加相应离心管和PCR反应混合物的份数。 将扩增试剂A和B分别分装到PCR扩增管中，24 μL/管。 1.3 加入扩增模板 在PCR扩增区内向每管扩增试剂中加入1 μL待检样品DNA（或阳性对照品、纯化水），作为PCR扩增的模板。每份PCR反应体系总体积为25 μL。 表5. PCR反应体系 反应管A 体积 （μL） PCR扩增试剂A 24 待检样品DNA 1 共计 25 反应管B 体积（μL） PCR扩增试剂B 24 待检样品DNA 1 共计 25 1.4 扩增 将PCR管置于PCR扩增仪中，按表6中的热循环程序进行PCR扩增反应。 表6. PCR反应热循环程序 温度（℃） 37 95 94 57 66 60 12 时间（s） 600 600 30 30 45 600 - 循环数 1 1 40 1 1 备注 PCR程序总反应时间约为2小时20分钟。 2.杂交 2.1实验前准备 l 芯片洗涤液： 根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液Ⅰ和Ⅱ。 ² 洗涤液I：SSC终浓度为0.3×，SDS终浓度为0.1%。以配制总量2000 ml为例，量取1950 ml纯化水倒入2500 ml试剂瓶中，加入30 ml 20×SSC，混匀。再加入20 ml 10 %SDS，混匀。 ² 洗涤液II：SSC终浓度为0.06×。以配制总量2000 ml为例，量取1994 ml纯化水倒入2500 ml试剂瓶中，加入6 ml 20×SSC，混匀。 提示：若10%SDS产生白色絮状沉淀，请于50℃水浴中融化混匀后配制洗液。 PCR扩增反应结束前，将杂交用仪器预热至50℃。 2.2 芯片的准备 在杂交盒的沟槽中加入300 ml纯化水（见图1），将芯片正面向上放入盒中，盖片四个凸台向下盖在芯片上（见图2），注意盖片的放置方向，其末端应与芯片末端的标签对齐。 图1 图2 重要提示： Ø 操作应在较干净的环境中进行，以避免灰尘落在芯片或盖片上，干扰结果判读。 Ø 不要用任何记号笔在芯片上做标记，否则可能造成芯片背景变脏，影响结果判读。 2.3 杂交反应混合物的配制 根据样品数目准备200 μl离心管并编号。从试剂盒中取出杂交缓冲液（白色盖），50℃加热使其完全融化。充分混匀后，在微量离心机中瞬时离心，按每份10 μl分装。 PCR扩增结束后，将同一样品的两管不同扩增体系管（A、B）扩增后的PCR产物各取2.5 μl加入到对应样品编号的10 μl杂交缓冲液管中（见表7），充分混匀并瞬时离心。 表7. 杂交反应混合物 杂交反应混合物组分 体积 ( μl ) 杂交缓冲液 10 PCR产物A 2.5 PCR产物B 2.5 共计 15 2.4 加样并开始杂交反应 用移液器将杂交反应混合物经盖片上的加样孔垂直加入到芯片上，14 ml/阵列（见图3）。迅速盖上杂交盒上盖，并密封（见图4）。每个微阵列限加一份样品，记录芯片编号、微阵列位置及对应的样品编号。 将密封好的杂交盒立即水平放入预热到50℃的杂交仪器中。待杂交盒全部放入后计时60分钟。 图3 图4 重要提示： Ø 加样过程中应避免加入气泡。 Ø 从加样开始至干燥芯片（步骤2.5）之前的任何一个环节中，均应避免芯片阵列上的液体长时间直接暴露在空气中，以防干燥造成芯片背景变脏，干扰结果的判读。 2.5 芯片洗涤液的准备 根据芯片数量，准备适量芯片洗涤液Ⅰ和Ⅱ，体积以洗涤时能够完全浸没芯片为准。将洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ放入恒温水浴摇床中，80 rpm匀速振摇，平衡至42 ℃（如果使用空气浴摇床，需事先将洗液预热平衡至42 ℃）。 2.6 芯片的洗涤与干燥 杂交反应结束后，将杂交盒水平取出拆开，将芯片取出，立即放在盛有平衡至42℃洗涤液Ⅰ的容器中（如有玻片架，可将玻片架置于盛有洗涤液的容器中，然后将芯片竖直插在玻片架上；如没有玻片架，可将芯片正面向上平放在容器底部），于预热至42℃的摇床上80 rpm洗涤2 min。 提示：注意不要使芯片相互碰撞、摩擦。 迅速将芯片从洗涤液Ⅰ中取出放入另一杯预热好的洗涤液Ⅱ中，42 ℃摇床 80 rpm洗涤2 min。将芯片放入微阵列芯片离心管，再放入离心机中1000 rpm离心2min，甩干后扫描。 3.芯片扫描 使用LuxScan™ 10K-B微阵列芯片扫描仪和相应的HPV分型检测系统进行信号读取及判断。具体操作见扫描仪及软件用户手册。 4.结果判读 检测结果由“HPV分型检测系统”进行自动判读。 【阳性判断值】 本试剂盒中各HPV型的cut off值主要采用ROC法计算得到。当各型探针的检测信号值大于或等于该探针的cut off值时，判断该探针为阳性，待检样品中含有该HPV型；当探针的检测信号值小于该探针的cut off值时，判断该探针为阴性，待检样品中不含有该HPV型。试剂盒中各型cut off值已经整合到HPV分型检测系统判别软件中，由软件自动对样品检测结果进行判别。 【检验结果的解释】 l 本试剂盒中对照品检测结果：HPV18型，如图5所示。 l 空白对照BC检测结果：应只有QC和PC出现阳性信号，软件提示无检测样品，如图6所示。 IC探针：阳性 HPV探