药监系统官方培训 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法(通则1106)解析 陕西省食品药品检验所

中国药典2015版非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法(通则1106)解析马英英陕西省食品药品检验所2015年8月16日主2015版控制菌检查法主要变化培养基适用性要内容方法适用性和供试品检查控制菌鉴定程序常用鉴定方法简介Ch.P2015控制菌检查主要变化检验项目2010版中国药典大肠埃希菌（E.coli）大肠菌群（Coliform）2015版中国药典大肠埃希菌（E.coli）耐胆盐革兰阴性菌（Bile-TolerantGram-Negative Bacteria）沙门菌（Salmonella）沙门菌（Salmonella）铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa）金黄色葡萄球菌（S.aureus）梭菌（Clostridia）铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa）金黄色葡萄球菌（S.aureus）梭菌（Clostridia）白色念珠菌（C.albicans）白色念珠菌（C.albicans）Ch.P2010Ch.P2015控制菌检查大肠菌群乳糖胆盐发酵培养基肠道菌增菌液体培养基（耐胆盐革兰氏阴性菌）乳糖发酵培养基紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基大肠埃希菌胆盐乳糖培养基胰酪大豆胨液体培养基麦康凯液体培养基麦康凯琼脂培养基4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基培养基沙门菌营养肉汤培养基胰酪大豆胨液体培养基RV 沙门菌增菌液体培养基木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基三糖铁琼脂培养基四硫磺酸钠亮绿培养基胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺菌属琼脂培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基三糖铁琼脂培养基铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基胰酪大豆胨液体培养基溴化十六烷基三甲銨琼脂培养基绿脓菌素测定用培养基溴化十六烷基三甲銨琼脂培养基金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基胰酪大豆胨液体培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基梭菌梭菌增菌培养基梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂培养基哥伦比亚琼脂培养基白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基念珠菌显色培养基沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基念珠菌显色培养基1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基Ch.P2015控制菌检查主要变化培养体系培养体系 增菌培养基（广谱增菌培养基替代选择性增菌培养基）、预增菌、选择性增菌、分离用培养基种类变化；培养时间与温度变化。方法 培养基的适用性发生变化。方法适用性发生变化（方法验证 方法适用性）。供试品 强抑菌性样品的处理方式发生变化。Ch.P2015控制菌检查主要变化-结果判断方式Ch.P2010Ch.P2015增菌、分离（纯化）、生 增菌、分离（纯化）、生化试验（较多）化试验（较少）适宜的鉴定试验 适宜的鉴定试验Ch.P2015：如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。（阳性对照可以不生长）培养基适用性测试项目接种量培养条件判断标准液体培养基促生长 100cfu 各控制菌检查培养条 与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。能力件规定最短时间固体培养基促生长 100cfu 各控制菌检查培养条 被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。能力件规定最短时间培养基抑制能力 100cfu 各控制菌检查培养条 试验菌应不得生长件规定最长培养时间培养基指示能力 100cfu 各控制菌检查培养条 被检培养基上试验菌生件规定培养时间内 长的菌落大小、形态特征、指示反应情况等应于对照培养基一致。培养基适用性控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道增菌肉汤促生长能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌抑制能力促生长能力+指示特性紫红胆盐葡萄糖琼脂麦康凯液体培养基铜绿假单胞菌大肠埃希菌大肠埃希菌沙门菌促生长能力抑制能力金黄色葡萄球菌大肠埃希菌促生长能力+指示特性麦康凯琼脂培养基RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力乙型副伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌+指示特性木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 促生长能力乙型副伤寒沙门菌三糖铁琼脂培养基指示能力乙型副伤寒沙门菌培养基适用性控制菌检查培养基特性试验菌株铜绿假单胞菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌+指示特金黄色葡萄球菌 甘露醇氯化钠琼脂培养基 促生长能力性抑制能力大肠埃希菌生孢梭菌梭菌梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力促生长能力促生长能力生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌+指示特+指示能沙氏葡萄糖琼脂培养基 促生长能力性念珠菌显色培养基促生长能力力白色念珠菌大肠埃希菌抑制能力方法适用性和供试品检查方法适用性微生物检验：某种样品采用某种方法得到一个检查结果。供试品 方法的影响 有效性方法适用性和供试品检查方法适用性Ch.P2010方法验证10100cfuCh.P2015方法适用性不大于100cfu名称加菌量培养要求在最苛刻的条件下培养（培养时间）结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性（非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）中的“抗菌活性的去除或灭活”），并重新进行方法适用性试验。结果判断：如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在该供试品，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。方法适用性和供试品检查-耐胆盐革兰阴性菌定性方法适用性和供试品检查-耐胆盐革兰阴性菌定量预培养：将制备好的1：10的供试液，在2025 培养，培养时间使供试品中的细菌恢复但不增殖（约2小时）耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N）每1g（或1ml各供试品量的检查结果或）供试品种可能的菌数cfu0.1g或0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml0.1ml相当于0.1g或ml、0.01g或ml、0.001g或ml样品+-N103102 N103肠道菌增菌液体培养基3035培养2448小时紫红胆盐葡萄糖琼脂+-10 N102N103035培养1824小时注：（1）+代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；-代表紫红单眼葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。（）若量减少 倍（如0.00供试品1ml，0.0001g或0.0001ml，10cm2样品），则每1g（1ml）供试品中可能的菌数（N）应相应增加10倍。VRBA：有菌落生长，检出耐胆盐革兰阴性菌，根据各培养管检查结果，查表得耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。210 0.01g 0.01ml 0.001g或或，阳性对照阴性对照方法适用性和供试品检查-耐胆盐革兰阴性菌耐胆盐革兰阴性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)替代2010年版大肠菌群Coliform）：耐胆盐革兰阴性菌为一群无严格定义的微生物，通常它们被定义为能够在紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基上生长的微生物。它们包括无乳糖发酵但能够利用葡萄糖，能够在胆盐中生长的革兰阴性菌，例如，肠杆菌科、假单胞菌和气单胞菌属的一些胆盐耐受的革兰阴性菌。方法适用性和供试品检查-耐胆盐革兰阴性菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）试验过程中第一步供试品加入胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂预培养是使待检菌“充分恢复”，但不增殖才能保证定量结果的准确；实际操作过程中如何保证“供试品中的细菌充分恢复但不增殖”还有待进一步实践摸索。（3）肠道菌增菌液体培养基（牛胆盐）（4）肠道菌增菌液体培养基在培养耐胆盐革兰阴性菌时，会出现变色和不变色两种情况。变色可能是由菌体大量增殖或其产生的初级和次级代谢产物影响到该培养基的pH值进而引起亮绿发生变色反应。耐胆盐革兰阴性菌中大部分是产酸的，会引起培养基颜色变化，（加入大肠试验是否变色）但也有不产酸或少产酸的（如铜绿假单胞菌）不会引起培养基变色。虽然该培养基会时而发生指示特性，但考虑到ICH中对颜色指示功能未作要求；耐胆盐革兰阴性菌包含细菌种类繁多，产酸能力差异大，颜色的改变也不统一，不宜统一要求；中成药本身颜色较深，可能会掩盖培养基颜色，影响颜色观察；等因素在修订时未加入该培养基的指示功能。试验中无论培养基浑浊与澄清，均应做分离培养、染色、镜检。方法适用性和供试品检查大肠埃希菌方法适用性和供试品检查大肠埃希菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基和麦康凯琼脂培养基在对供试品进行前增菌或选择性增菌时，尽量采取标准培养温度和培养时间的上限进行，有利于菌体的复苏、增殖和检出，尤其是对污染较轻或污染菌受损较严重的供试品。对于污染严重的供试品可根据实际情况按标准调节培养温度和时间。（3）药品中污染的大肠埃希菌，易受生产工艺及药物的影响，在麦康凯琼脂培养基上的菌落形态特征会发生变化。检验者在挑选菌落时都会尽量挑选最典型的菌落，但形成典型菌落的不一定是大肠埃希菌，部分非典型菌落也会是大肠埃希菌，因此该试验对检验者的经验要求较高，也造成了一定的主观性。要求检验者尽量多挑选菌落进行鉴别，以防漏检。方法适用性和供试品检查沙门菌方法适用性和供试品检查沙门菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）Ch.P2015沙门菌检查方法和所用的培养基较Ch.P2010更加完善。在相同实验条件下，TSB 较营养肉汤培养基更加丰富，更有利于细菌的复苏和繁殖，对营养要求苛刻的细菌也能很好的培养。RV沙门菌增菌肉汤的高渗透压，低pH和孔雀绿的抑菌作用使培养基的选择性作用更强，不仅抑制了革兰阳性菌，对肠杆菌科的细菌也具有不同程度的抑制作用。木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基上沙门菌特有的形态特征更有利于观察。（血清分型）（3）随着科学技术的发展，药典控制菌检查鉴别方法不作具体规定，由各实验室根据自身条件自行选择，以适应先进技术的发展，与国外药典控制菌检查的发展趋势同步。这就要求各实验室要具备相当的条件设备和技术能力，才能适应新时期药品质量控制的要求。方法适用性和供试品检查铜绿假单胞菌检查方法方法适用性相当于1g、1ml、10cm2样品相当于1g、1ml、10cm2样品胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基（铜绿）3035培养1824小时溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板3035培养18小时溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板3035培养18小时3035培养1872小时与阳性对照相比，菌落形态一致，阳性对照计数不大于100cfu。取平板上的菌落进行氧化酶试验或采用其它适宜方法进一步鉴定。阳性对照阴性对照方法适用性和供试品检查铜绿假单胞菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）在进行铜绿假单胞菌检验时，传统的方法是在分离纯化之后，进行革兰染色镜检、氧化酶试验，再进行一系列的绿脓菌素试验或者硝酸盐还原产气试验、42生长试验和明胶液化试验，也比较时力。与传统方法比较，用（如自微生物鉴定系统、PCR等）准确性高，鉴定度，但用较高。各实验室根据自身条件自行选择结品本身特，检验时限等因素，选择适宜的方法，会高检验的和准确性。方法适用性和供试品检查金黄色葡萄球菌检查方法方法适用性方法适用性和供试品检查金黄色葡萄球菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）在进行金黄色葡萄球菌检验时，传统方法是在分离纯化，革兰染色镜检之后使用兔血浆进行血浆凝固酶试验，而兔血浆的质量和新鲜程度要求相对较高，否则容易得出假阴性结果。虽然在实验的同时使用了阳性对照和阴性对照作为参考，但遇到上述情况也比较费时费力，且对于凝固与否需要人工判断，结果又会有误差。与传统方法比较，借用仪器（如VITEK、PCR、RP等）准确性高，鉴定速度快，但费用较高。各实验室根据自身条件自行选择结合样品本身特点，检验时限等因素，选择适宜的