禽流感病毒通用性内标测试与优化实验方案

禽流感病毒通用性内标测试与优化荧光RT-PCR试验方案 一、试验目的 1.测试禽流感病毒通用性内标进行荧光RT-PCR试验情况，包括内标能否进行扩增、最低浓度（最大Ct值）内标的选取与加入反应体系中的量等。 2.测试禽流感病毒通用性加内标与不加内标进行荧光RT-PCR试验灵敏度的影响。 二、试验原理 禽流感病毒通用性内标基因序列与禽流感病毒通用性所检测的RNA片段序列一致，使用相同的上、下游引物，不同的荧光探针进行荧光RT-PCR试验，属于竞争性内标。 三、试验材料 已知浓度（Ct值）禽流感病毒H5亚型抗原提取RNA；禽流感病毒通用性内标；禽流感病毒通用性上、下游引物及荧光探针；内标荧光探针；Master Mix；Taq酶与逆转录酶；制备假病毒相关材料与离心柱提取试剂等。 四、试验步骤 1.2.25am 测试合成的禽流感病毒通用性内标进行荧光RT-PCR情况： 1）根据内标管壁标注，使用相应量DEPC水进行溶解(20μL），取1μL进行试验使用，其余-20℃保存。取1μL内标原液进行10倍的倍比稀释，稀释成5种浓度的内标。 2）配制50T内标P Mix，荧光RT-PCR反应体系的配制 材料 1T（μL） 9T（μL） Master Mix 6 54 内标P Mix 1 9 Taq 酶 0.5 4.5 AMV 酶 0.5 4.5 模版 2 / DEPC H2O 15 135 Total 25 207 将9T反应液加入到7个反应孔中，每孔23μL，前5个反应孔依次加从低到高稀释浓度的内标，每孔2μL，后2孔加DEPC水做阴性对照。 结果： 2.通过低浓度内标进行荧光RT-PCR情况，确定最大Ct值又能特异扩增的内标浓度： 1）根据1试验结果，选取出Ct值为30以后且有明显特异性扩增曲线的稀释内标（10-9），再进行3倍倍比稀释，稀释成Ct值相差约为1的四种浓度内标（10-9、10-9.5、10-10、10-10.5、10-11），再进行荧光RT-PCR试验，确定能进行特异性扩增的最低浓度内标。 2）荧光RT-PCR反应体系的配制： 材料 1T（μL） 8T（μL） Master Mix 6 48 内标P Mix 1 8 Taq 酶 0.5 4 AMV 酶 0.5 4 模版 2 / DEPC H2O 15 120 Total 25 184 ①2.25pm 将8T反应液加入到7个反应孔中，每孔23μL，前5个反应孔依次加从低到高稀释浓度的内标，每孔2μL，后2个孔加DEPC水作为对照。根据试验结果，选择最适浓度内标（Ct值约36左右）。 结果： 10-9 Ct值为35.805，符合能进行特异性扩增的最低浓度内标（Ct值约36左右）。 ②2.26am 根据2.25am的结果，可以进行的下一步实验，虽然实验当天有错误，但内标10-9没有扩增曲线，结果如下： ③2.27am 根据2.26am结果，怀疑实验室有污染，决定再做10-8、10-8.5、10-9，做4个平行副孔，并用TE做阴性对照，结果如下： 根据结果，最后还是确定用内标浓度为10-9进行最低浓度内标对低浓度禽流感病毒H5亚型抗原荧光RT-PCR的灵敏度影响的测试。 3.2.27pm 测试最低浓度内标对低浓度禽流感病毒H5亚型抗原荧光RT-PCR的灵敏度影响： 1）选择Ct值为36~39左右的四种浓度禽流感病毒H5亚型抗原RNA，进行荧光RT-PCR试验，配制50T内标与禽流感病毒通用性P Mix： 材料 1T（μL） 50T（μL） 100 uM F 0.1 5 100 uM R 0.1 5 100 uM 禽流感病毒Pb 0.05 2.5 100 uM内标Pb 0.05 2.5 1×TE 0.7 35 Total 1 50 2）荧光RT-PCR反应体系的配制： 材料 1T（μL） 14T（μL） Master Mix 6 84 内标与禽流感病毒通用性P Mix 1 14 Taq 酶 0.5 7 AMV 酶 0.5 7 H5亚型抗原RNA 5 / 模版 2 28 DEPC H2O 10 140 Total 25 280 将14T反应液加入到14个反应孔中，每孔20μL，前4孔加浓度为10-6的禽流感病毒H5亚型抗原RNA5μL和浓度为10-9的内标2uL，后四孔加浓度为10-6的禽流感病毒H5亚型抗原。第二个八联管前4孔加浓度为10-5的禽流感病毒H5亚型抗原RNA 5μL和浓度为10-9的内标2uL,后两孔加DEPC水作为阴性对照。 结果如下： 10-6抗原对内标的竞争性抑制明显，而10-5抗原对内标的抑制作用不明显。