血pbmc标提取方法.docx

血PBMC标提取方法：样本类别：全：术前血全血样本紫色收集管：抗凝血，收集血浆黄色收集管：促凝血，收集血清抗凝血1. 首先将抗凝管上的病人信息登记至记录本上，住院号、姓名、（主要针对HCC病人）2. 抗凝血进行离心，3000rpm,10min.3. 将上清即血浆（OP），每管分装500ul到2ml EP管，标记样本编号（住院号、样品类别），放置-80度冰箱保存注意：10ml抗凝管里留约0.5ml上清，避免将血细胞和淋巴细胞吸出，污染血浆（OP）4. 往抗凝管中补加PBS（或生理盐水）至满约12.5ml，用3ml滴管吹打，充分混匀5. （一管血对应提两管淋巴细胞）取2支15ml离心管，分别加3ml淋巴细胞分离液6. 向每支离心管中，淋巴细胞分离液层上加步骤4中用PBS（或生理盐水）稀释液并充分混匀后的血样 约6ml，（这一步操作一定要小心：管壁倾斜，将血沿管壁轻缓加入，保证淋巴分离液和血样的界面清晰，不能将血与淋巴细胞分离液相混）7. 室温25℃，离心400g,30min，可见分层分为四层，最上层为黄色是稀释血浆，接下来是目的层，为白色云雾状淋巴细胞层，接下来是一个白色的粒细胞层，最下面是血细胞。

8. 每管小心吸取中间白色云雾状单个核细胞9. 约1ml，加至 2mlEP管中10. 加入等量的PBS（或生理盐水），上下颠倒混匀，离心1500rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀，获得单个核细胞沉淀，为OB, 标记样本编号（住院号、样品类别）11. 加入1ml PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，再次离心，1500 rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀12. 加入200uL PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，均分为两个EP管（100Ul/管），加入流式抗体1.5uL，室温避光孵育30min13. 如果当天能上机流式：再加入1ml PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，离心，1500 rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀；加入300uL PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，避光上机 14. 如果当天不能上机：再加入1ml PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，离心，1500 rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀；加入300uL 1%多聚甲醛,用枪轻轻吹打混匀，避光保存（固定），第二天上机。