噬菌体检测技术.ppt

一、噬菌体基础生物学,Dave HO gzzsu,噬菌体本质,噬菌体只感染细菌的病毒 携带基因组从一个敏感的细菌细胞到另一个细胞 噬菌体颗粒（病毒子）核酸基因组（DNA或RNA）编码蛋白或脂蛋白外壳（或衣壳）；共同构成核衣壳 每种噬菌体的靶宿主是一组特异性的细菌 严格寄生，携带指导复制的全部信息，但缺乏能量产生的机制，也没有制造蛋白的核糖体 地球上最为丰富的生命体,超过90%的噬菌体属于有尾噬菌体 其病毒子将近一半是双链DNA，另一半是蛋白质集合而成 带有二十面体的头部，交角五聚体，面六聚体 尾部形态分为三个科：60%为长尾噬菌体科，25%为短尾噬菌体科，15%为肌尾噬菌体科,基本噬菌体形态,“家庭照”：噬菌体ø29和T2 Dwight Anderson提供电子显微照片噬菌体T4 数字表示基因编码的每种结构,生活方式有：烈性噬菌体（virulent ）或温和噬菌体（temperate ） 感染性噬菌体可以有选择地启动一个溶原性周期；而不是复制 溶原性状态是高度进化的结果，需要病毒和宿主共同进化，或许反映了两者的多方面优势，温和噬菌体可以帮助保护其宿主免受其它噬菌体的感染，可以引导有意义的宿主特征改变 较大的烈性噬菌体通常编码许多宿主致死性蛋白,噬菌体感染过程,吸附：尾丝或尾钉结合到特异性的表面分子或粘多糖外壳时，有尾噬菌体的感染就开始了，任何蛋白、寡糖、和脂多糖都能起到一些噬菌体受体的作用 。

T4样噬菌体必须至少将三组他们的六条长尾丝的结合到初级受体分子，来触发尾板成分的重新排列，随后不可逆地结合到二级受体科内的不同成员利用完全不同的初级受体，但他们似乎都利用LPS内部核心的庚糖基作为其二级受体,穿透：不可逆吸附后，基因组通过尾进入宿主细胞，但不是实际意义的“注射”噬菌体尾具有一种酶的机制来穿透肽聚糖层，然后接触或穿透内膜释放DNA直接进入细胞；尾的结合还会开发一种机制，一直阻碍DNA从衣壳出来的出口，直到完全定位到一个潜在的宿主细胞为止从宿主到噬菌体指导的代谢转换：起始步骤通常包括对宿主RNA多聚酶识别很强的噬菌体启动子，导致转录早早期基因这些基因的产物可以保护噬菌体基因组和重建宿主适于噬菌体的需要；他们可以灭活宿主蛋白酶并阻碍限制性酶，直接终止各种宿主大分子生物合成，或破坏一些宿主蛋白一组中期基因常常接着被转录，产生合成新噬菌体DNA的产物，随后是编码噬菌体颗粒成分的一组晚期基因对有些噬菌体而言，这些转换包括合成新的σ（sigma）因子或DNA结合蛋白改编宿主RNA多聚酶；而另一些噬菌体编码其自身的RNA多聚酶降解宿主DNA和抑制宿主mRNA的翻译是另外的一些机制，可以促使细胞改编合成新噬菌体。

形态发生：在多数噬菌体中，他们的装配涉及特异性的骨架蛋白和主要头部结构蛋白之间的复杂相互作用，随后蛋白水解分裂骨架蛋白和主要头部结构蛋白的N末端在包装之前和包装期间，头部扩张并变得更稳定，伴有内部容积适合DNA的增加位于头部的一个顶点是一个入口联合体，成为头部装配起始点、DNA包装酶入坞位点、通过DNA的一个管道、以及肌尾噬菌体和长尾噬菌体的噬菌体尾部（被分开装配）结合位点细胞裂解：是一种时机紧密受控的急促事件，如果裂解偶然过早，将很少会有新噬菌体会确保有效地继续这种周期；如果裂解延迟过久，重复感染和重复一个新爆发周期的时机将会丧失有尾噬菌体都利用两种成分来裂解：溶细胞素（lysin）─能分解肽聚糖基质中的重要键的一种酶，以及控时蛋白（holin）─在膜内侧聚集有孔，在适当时机使溶细胞素作用肽聚糖层并促使裂解的一种蛋白该时机受生长条件和遗传影响；改变裂解时机的突变能加以选择T4感染周期,二、噬菌体检测技术,引言,噬菌体与宿主细胞的特异性相互作用 一种天然进化来的体系 具有不同裂解谱的噬菌体，形成噬斑，辨别细菌种间或属间的分离物 感染性方面的差异有：细胞表面受体，限制性修饰系统，前噬菌体或质粒携带等 实验结果高度重复性 花费不多，依然是细菌菌株鉴定最广泛使用的方法,重组(信号)噬菌体,信号基因（reporter genes）导入到噬菌体 细菌生物发光（lux）基因，照度计检测，检出10个大肠埃希氏菌/单位 荧光素酶信号噬菌体（LRP），检测肉类和蛋类中沙门氏菌 luxAB基因导入噬菌体结构基因，检测单核细胞增多症李斯特氏菌 底物乙醛扩散与酶发生反应发光 GMOs使用受限制,信号基因(如lux、ina、或gfp)被引入到噬菌体基因组和被包装到噬菌体颗粒中的重组DNA中。

信号噬菌体与标本混合，但只感染敏感的宿主，免去了在测定前纯化生物的需要随着感染，信号噬菌体基因组被复制，信号基因表达一旦足够的信号蛋白积累了，表达的信号基因便能被检测噬菌体展示,彻底变革了用亲和技术结合特殊物质分离多肽的历史 已克隆序列与噬菌体外壳蛋白一起得到表达，嵌入成熟噬菌体颗粒，在成熟病毒粒子表面得以“展示” 应用于医学或制药学，鉴定各种病毒 ，区别假丝酵母种 ，检测棒状菌芽孢,肽文库片段作为与Fd噬菌体基因III(次要壳蛋白)或VIII(主要壳蛋白)融合的蛋白而被克隆如果肽与基因III蛋白融合，只有很少的肽拷贝展示在噬菌体上，但可以形成功能性噬菌体，无须互补如果肽与基因VIII蛋白融合，就必须在宿主细胞中反式提供野生性gpVIII，以便合成活性噬菌体颗粒，含有天然gpVIII和融合成肽序列的gpVIII的一种混合物噬菌体文库暴露于联接到一种支持物的靶向配基，并且没有联接的噬菌体被清洗除去结合了的噬菌体被提取出来并且生长为足够数量的具有所期望的键亲和力的噬菌体利用更为严格的洗脱方式，重复该生物淘选过程，最终分离出具有最高键合亲和力的噬菌体这些就是噬斑纯化和克隆插入序列分析二重噬菌体,不用宿主－噬菌体关系的特异性来完成检测项目 靶分子特异性的抗体被共价地连接到两种不同的转换噬菌体的表面,在这种检测中，使用了两种转导性噬菌体，能转导对两种抗生素的耐药性基因到一个宿主细胞中。

针对靶抗原的的抗体被化学性地结合到转导性噬菌体；如果使用针对靶抗原不同决定簇的抗体，就能增加这种检测方法的特异性这种抗体标记的噬菌体与靶抗原混合并允许结合标本与宿主细胞以适当的稀释比例混合，确保了随机共同感染宿主细胞是一件罕见的事件被感染的宿主细胞铺板在含有两种抗生素的培养基上，从而选择出已被双重转导了的细胞这仅仅发生在噬菌体结合到相同抗原颗粒密切聚集之处(琼脂平板上的菌落代表一个阳性结果)噬菌体扩增检测,不利用任何修饰过的噬菌体，并且检测终点是形成的一个噬斑 新的检测试验很快能被建立起来，对新的疑难细菌出现做出回应 噬菌体开始感染靶病原细菌可以逐步形成一个噬斑，因此提供了扩大发出信号的结果,这种检测方法需要的是非修饰的噬菌体靶细菌的噬菌体与标本混合并允许感染易感性的细胞一旦噬菌体进入了隐蔽期噬菌体，加入一种杀病毒剂，但不影响靶细菌外部的没有感染细胞的噬菌体被杀灭，只有幸存的活性噬菌体才是那些顺利感染了宿主细胞的噬菌体杀病毒剂随后被中和，而含有受感染细胞的标本与能支持噬菌体复制的辅助细胞混合(它们不一定与靶细菌相同)这种混合物铺板接种在琼脂平板上，并孵育以便菌苔形成在受感染细胞内的噬菌体完成它们的复制周期，裂解宿主细胞，并且后裔噬菌体在菌苔上感染辅助细胞，导致形成一个噬斑。

三、食品安全与噬菌体技术,人类健康和公共卫生事业面对挑战,WHO1996年报告指出：我们正处在一场全球感染性疾病危机的边缘，没有一个国家可以幸免，也没有一个国家能承受因忽视此威胁带来的后果WHO2000年 “世界卫生组织全球沙门氏菌监测”规划WHO2001年 “世界卫生组织全球食品安全战略”,噬菌体技术综合应用 控制食物源性细菌性疾病,○农场到餐桌食物链；○监测是控制基础，预防杀菌是手段；○降低抗生素积累和耐药性传播重要目标；○噬菌体在食物链发挥作用沙门氏菌、志贺氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌,,,,,,,,,,,裂 解 法,扩 增 法,预 防 治 疗,食 品 杀 菌,国 家 标 准,1CFU 国 标,应 用 推 广,应用研究,技 术 路 线,表1. 噬菌体诊断试剂技术参数指标的国内、国外同类技术的比较 ——————————————————————————————————————————————————参数/技术种类 噬菌体裂解法 噬菌体扩增法 生化学方法 血清学方法 自动分析仪 ——————————————————————————————————————————————————方法和用途 沙门氏菌、 沙门氏菌 、 47项， 分群血清和 项目多自动志贺氏菌、 志贺氏菌、 复杂但准确 亚群血清 分析但某些大肠埃希氏菌 大肠埃氏菌、 经典方法 有属外种外 重要的生化金黄色葡萄球菌 交叉 项目不能入机如氰化钾试验等纯培养物 需要 不需要 需要 需要 需要检验周期 纯培养后6小时 6小时 3-4天 3-4天 24-48小时误诊误判 极低≤0.05% 低≤0.05-0.5% 极低 较高 较高鉴定到属 可以 可以 可以 不可以 可以检验条件 一般条件 一般条件 条件复杂 一般条件 设备试剂贵 常规性 可以 可以 可以 可以 不可以大通量检验 可以 可以 不可以 不可以 可以遗漏补救 五项生化 五项或多项生化 不需要 使用噬菌体 使用噬菌体使用历史 20余年 国外3-4年 长期 长期 近6-7年实用性 普遍 新技术 普遍 普遍 有限廉价性 高≤1元/标本 高（同前） 较高 不高 很低国产化程度 高 高 较高 较高 不高是否国家标准 是 新技术 是 是 不是 ——————————————————————————————————————————————————,。