19 喹乙醇检测细则.pdf

福建森宝食品集团股份有限公司企业标准 Q JCWI 0219 2013 动物性食品中动物性食品中喹乙醇喹乙醇代谢代谢残留检测残留检测 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 2013 08 01 发布 2013 08 01 实施 福建森宝食品集团股份有限公司 发 布 Q JCWI 0219 2013 I 前 言 本标准按照GB T 1 1 标准化工作导则 第1部分 标准的结构和编写 给出的规则起草 本标准由公司检测中心提出并审核 本标准起草单位 检测中心 本标准起草人 张超红 本标准批准人 黄金兰 本标准于2013年8月1日首次发布 Q JCWI 0219 2013 II 修改履历表修改履历表 版本版本 章节章节 条款条款 修改内容或记录号修改内容或记录号 修改人修改人 起草人 起草人 批准人批准人 修改日期修改日期 发布日期 发布日期 实施日期实施日期 A 0 全新发布 张超红 黄金兰 2013 8 1 2013 8 1 Q JCWI 0219 2013 1 动物性食品中动物性食品中喹乙醇喹乙醇代谢代谢残留检测残留检测 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物可食性组织中喹乙醇代谢残留量 酶联免疫检测方法的制样和检测方法 本标准可定性 定量检测动物组织 鸡肉 猪肉 鱼 虾 样本中MQCA的残留量 2 试验原理 本试剂盒采用间接竞争ELISA方法 在酶标板微孔条上预包被抗MQCA抗体 样本中残留的MQCA与酶 标记的MQCA竞争微孔条上的MQCA抗体 用TMB底物显色 样本吸光度值与其所含残留物MQCA的含量成负 相关 与标准曲线比较 再乘以其对应的稀释倍数 即可得出样本中MQCA的残留量 3 交叉反应率 MQCA 100 QCA 100 喹乙醇 1 卡巴氧 1 4 设备及试剂 以下所用材料 除特别注明者外 均为分析纯 水为符合以下所用材料 除特别注明者外 均为分析纯 水为符合GB T 6682GB T 6682规定的二级水 规定的二级水 4 1 设备 微孔板酶标仪450 630nm 旋转蒸发仪 氮气吹干装置 均质器 振荡器 涡旋仪 离心机 天平 感量0 01g 刻度移液管 10ml 洗耳球 容量瓶 100ml 500ml 聚苯乙烯离心管 50ml Q JCWI 0219 2013 2 微量移液器 单道 20 200 l 100 1000 l 多道 250 l 4 2 试剂 氢氧化钠 分析纯 浓硫酸 分析纯 去离子水 5 试剂盒提供的材料与试剂 96孔酶标板 1块 包被有偶联抗原 标准品 6瓶 1ml 瓶 0ppb 0 5ppb 1 5ppb 4 5ppb 13 5ppb 40 5ppb 高浓度标准品 1ml 瓶 1ppm 酶结合物浓缩液 1ml 酶结合物稀释液 10ml 底物液 A液 7ml 底物液 B液 7ml 终止液 7ml 20 浓缩洗涤液 40ml 2 浓缩复溶液 50ml 6 溶液的配制 配液1 2M 氢氧化钠溶液 称取40 0g氢氧化钠加入到500ml去离子水中溶解混匀 配液2 0 25M 硫酸溶液 移取1 35ml浓硫酸加入到去离子水中定容至100ml 混匀 配液3 复溶工作液 用去离子水将2 浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释 1份2 浓缩复溶液 1份去离子水 用于提取样 本的复溶 复溶工作液在4 39 2 环境可保存一个月 配液4 洗涤工作液 用去离子水将20 浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释 或按需量稀释 1份20 浓缩洗涤液 19份 去离子水 用于酶标板的洗涤 洗涤工作液在4 39 2 环境可保存一个月 7 样本前处理步骤 7 1 处理任何样本时 都必须注意 a 实验中必须使用一次性吸头 在吸取不同的试剂时要更换吸头 b 实验之前须检查各种实验器具是否洁净 必须使用洁净实验器具 以避免污染干扰实验结果 c 处理好的样本不可保存 7 2 样本前处理方法 Q JCWI 0219 2013 3 用均质器均质组织样本 称取2 0 0 05g 均质物至50ml 聚苯乙烯离心管中 加入2ml 0 25M硫酸溶液 见配液2 用 振荡器振荡3min 再加入0 25ml 2M 氢氧化钠 见配液1 3 75ml复溶工作液 见配液3 振荡3min 3000g以上 室温 20 25 68 77 离心5min 取上清液50ul用于分析 8 检测步骤 8 1 测定前应须知 测定前应须知 1 使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温 20 25 68 77 2 使用之后立即将所有试剂放回2 8 36 46 3 在ELISA分析中的再现性 很大程度上取决于洗板的一致性 正确的洗板操作是ELISA测定程序 中的要点 4 在所有恒温孵育过程中 避免光线照射 用盖板膜封住微孔板 8 2 操作步骤 8 2 1 将所需试剂从冷藏环境中取出 置于室温 20 25 68 77 平衡 30min 以上 注意每种液体 试剂使用前均须摇匀 8 2 2 取出需要数量的微孔板 将不用的微孔板放入自封袋 保存于 2 8 36 46 8 2 3 浓缩复溶液和浓缩洗涤液在使用前也需回温 8 2 4 编号 将样本和标准品对应微孔按序编号 每个样本和标准品做 2 孔平行 并记录标准孔和样 本孔所在的位置 8 2 5 酶结合物工作液配制 根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液 见提供的材料与试剂 5 按 1 10 体积比进行稀释 即 1 份酶结合物浓缩液加入 10 份酶结合物稀释液 注1 配制好的酶结合物工作液可于 2 8 36 46 环境保存 1 周 8 2 6 加标准品 样本和酶结合物工作液 加标准品 样本 50 l 到对应的微孔中 然后加入酶结合物 工作液 50 l 孔 轻轻振荡混匀 用盖板膜盖板后置 25 77 避光环境中反应 30min 8 2 7 小心揭开盖板膜 将孔内液体甩干 加入洗涤工作液 250 l 孔 见配液 4 充分洗涤 4 5 次 每次间隔 10s 泼掉板孔内液体 用吸水纸拍干 拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破 8 2 8 显色 加入底物液 A 液 50 l 孔 再加入底物液 B 液 50 l 孔 轻轻振荡混匀 用盖板膜盖 板后置 25 77 避光环境反应 15min 见注意事项 8 8 2 9 测定 加入终止液 50 l 孔 轻轻振荡混匀 设定酶标仪于 450nm 处 建议用双波长 450 630nm 检测 请在 5min 内读完数据 测定每孔 OD 值 若无酶标仪 则不加终止液用目测法可进行判定 9 结果判定 结果判定有两种方法 粗略判定可用第1种方法 定量判定用第2种方法 注意样本吸光度值与其所 含MQCA的含量成负相关 9 1 用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围 ppb 假设样本1的吸光度值为0 511 样本 2 的吸光度值为 0 985 标准品吸光度值分别是 0ppb 为 2 185 0 5ppb 为 1 778 1 5ppb 为 1 264 4 5ppb 为 0 72 13 5ppb 为 0 305 40 5ppb 为 0 131 则样本 1 的浓度范围是 4 5ppb 13 5ppb 再乘以 Q JCWI 0219 2013 4 其对应的稀释倍数即可得出样本中 MQCA 残留的浓度范围 样本 2 的浓度范围是 1 5ppb 4 5ppb 再乘以 其对应的稀释倍数即可得出样本中 MQCA 残留的浓度范围 9 2 定量测定 9 2 1 百分吸光率的计算 标准品或样本的百分吸光率等于 标准品或样本的平均吸光度值 双孔 除 以第一个标准 0 标准 的平均吸光度值 再乘以 100 即 百分吸光率 B 100 B0 B 标准品或样本溶液的平均吸光度值 B0 0ppb标准溶液的平均吸光度值 9 2 2 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标 以MQCA标准品浓度 ppb 的对数为横坐标 绘制标准曲线图 将样 本的百分吸光率代入标准曲线中 从标准曲线上读出样本所对应的浓度 乘以其对应的稀释倍数即为样 本中MQCA实际浓度 样本稀释倍数 猪肉 鸡肉 牛肉 羊肉 鱼 虾样本稀释倍数 4倍 检测方法灵敏度 准确度 精密度 试剂盒灵敏度 0 5ppb 10 检测方法灵敏度 准确度 精密度 样本最低检测限 猪肉 鸡肉 牛肉 羊肉 2 0ppb 准确度 猪肉 鸡肉 牛肉 羊肉 95 15 试剂盒的板内 板间变异系数均小于10 11 注意事项 11 1 室温低于 20 68 或试剂及样本没有回到室温 20 25 68 77 会导致所有标准的 OD 值偏低 11 2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况 则会出现标准曲线不成线性 重复性不好的现象 所以 洗板拍干后应立即进行下一步操作 11 3 每加一种试剂前需要将其摇匀 11 4 反应终止液为 2M 硫酸 避免接触皮肤 11 5 不要使用过了有效日期的试剂盒 也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂 掺杂使用过了 有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低 不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂 11 6 储存条件 Q JCWI 0219 2013 5 11 7 保存试剂盒于 2 8 36 46 不要冷冻 将不用的微孔板放回铝箔袋重新密封 标准物质 和无色的发色剂对光敏感 因此要避免直接暴露在光线下 11 8 试剂变质的迹象 11 9 发色试剂有任何颜色表明发色剂变质 应当弃之 0 标准的吸光度 450 630nm 值小于 0 5 A450nm 0 5 时 表示试剂可能变质 11 10 在加入底物液 A 液和底物液 B 液后 一般显色时间为 10 15min 即可 若颜色较浅 可延长反应 时间到 20min 或更长 但不得超过 25min 反之则减短反应时间 11 11 该试剂盒最佳反应温度为 25 温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接 影响检测结果 12 贮藏条件及保存期 贮藏条件 保存试剂盒于2 8 36 46 环境中 保存期 该产品有效期为12个月 。