干细胞的培养条件和培养基.pdf

干细胞的培养条件干细胞的培养条件 1. 培养条件 1. 环境：细胞培养需要一个无菌的环境，所以尽量是在一个独立的房间里进行要求配有空气净化系统， 能够对整个房间进行杀菌的紫外灯 2. 设备：二氧化碳培养箱、超净工作台、倒置显微镜、冰箱、水浴锅、离心机、实验桌、移液器等 3. 实验耗材：一次性的细胞培养皿或细胞培养瓶、15ml 或 50ml 离心管、脱脂棉花、封口膜等 4. 试剂：干细胞对培养条件要求较高，可以根据自己的条件，尽量选用质量好的各种试剂 5. 试剂的配制： 1. DMEM 培养基: 去离子水中含 1.34% DMEM 粉末、0.22%NaHCO3 2. MEF 培养基：DMEM 培养基中含 10%FBS, 1000u/ml 青霉素, 1000g/ml 链霉素 3. ES 培养基: ES 培养基：DMEM 培养基中含 15% FBS，1×106 U 青霉素，1×106 g 链霉素，1mM 丙酮 酸钠, 0.1mM 非必须氨基酸, 2mM 谷氨酰胺, 0.1mM 巯基乙醇, 1000u/ml 白血病抑制因子 4. D-Hank's： 0.8%NaCl, 0.04%KCl, 0.035%NaHCO3, 0.006%KH2PO4, 0.005325%Na2HPO4, 0.001% 酚红 5. 0.1%明胶: D-Hank’s 溶液中含 0.1%的明胶 6. ES 细胞冻存液：90% ES 培养基，10% DMSO 7. MEF 细胞冻存液：90% MEF 培养基，10% DMSO 8. Feeder 细胞冻存液：90% FBS ，10% DMSO 9. 丝裂霉素 C: 根据产品说明书来配制 2. 培养步骤 常见的干细胞培养是胚胎干细胞（ES cells）培养。

我们以小鼠的胚胎干细胞培养为例 1. 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的复苏 胚胎干细胞一般是在 37℃、5%CO2 和 95%湿度的培养条件下，生长在铺有一层滋养细胞层的细胞培养 皿或者是细胞培养瓶中（此处以细胞培养皿为例）因此要先铺滋养层细胞 1. 在 37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎成纤维细胞 2. 把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的 MEF 培养基的无菌离心管中，轻轻混匀后，1000×g ， 5min 离心收集细胞 3. 吸掉上清（除去冻存液中的 DMSO），用 10ml 预热的 MEF 培养基重悬细胞后，加到一个 10cm 的细 胞培养皿中，放入 37℃，含有 5%CO2 的加湿培养箱中培养 4. 根据情况对细胞进行换液，大约 4 天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻存 或用于制备滋养细胞层 2. 滋养细胞层（feeder cells layer）的制备 1. 把长好的小鼠胚胎成纤维细胞的培养基吸掉，加入 10ml 新鲜的 MEF 培养基，并在避光的条件下加入 110μl 配好的丝裂霉素 C，混匀后放入培养箱培养 2h。

2. 把含有丝裂霉素 C 的培养基用无菌的 15ml 离心管收集起来避光保存，在一周之内可再次使用（直接使 用该培养基处理细胞 5h）用 PBS(不含二价离子)洗涤细胞 2 到 3 次后，用 1ml 含有 EDTA 的胰酶消 化细胞，37℃培养箱放置约 3min，直到细胞悬浮起来 3. 用 1ml MEF 培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g 离心 5min 4. 去掉上清，用 1ml MEF 培养基重悬细胞，之后把细胞平均分到两个经过 0.1%明胶处理过的细胞培养皿 中，用 MEF 培养基培养细胞明胶处理：加 5ml 0.1%的明胶到细胞培养皿中，在 37℃培养箱中至少 放置 10min，之后把明胶吸掉即可） 5. 一般处理好的小鼠胚胎成纤维细胞在 1~2h 之后即可以贴壁，形成滋养细胞层，这时的滋养细胞层即可 用来培养小鼠胚胎干细胞制备好的滋养细胞层可以在 MEF 培养基中保持 1 周左右的时间，或者是把 细胞冻存 3. 小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的复苏 1. 在 37℃水浴锅里快速融化一管液氮冻存的小鼠胚胎干细胞。

2. 把融化的细胞悬浮液加到装有几毫升预热好的 ES 培养基的无菌离心管中， 轻轻混匀后， 1000×g ， 5min 离心收集细胞 3. 吸掉上清（除去冻存液中的 DMSO，用 10ml 预热的 ES 培养基重悬细胞后，加到一个 10cm 的铺有滋 养细胞层的细胞培养皿中，放入 37℃，含有 5%CO2 的加湿培养箱中培养 4. 根据情况对细胞进行换液，大约 3~4 天左右，细胞就可以基本长满整个培养皿，这时可以进行传代、冻 存或用于后续试验 4. 小鼠胚胎干细胞的传代 1. 吸掉培养基，用 PBS(不含二价离子)洗 2~3 次后，加 1ml 含有 EDTA 的胰酶消化细胞，37℃培养箱放 置约 5min，直到细胞基本悬浮起来 2. 用 1ml ES 培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g 离心 5min 3. 去掉上清，用几毫升 ES 培养基重悬细胞，之后根据培养皿规格和分配比，把细胞按一定比例分到铺有 滋养细胞层的细胞培养皿中，加 ES 培养基培养ES 细胞的分配比可以是 1:1 到 1:10 5. 小鼠胚胎干细胞的冻存 1. 吸掉培养基，用 PBS(不含二价离子)洗 2~3 次后，加 1ml 含有 EDTA 的胰酶消化细胞，37℃培养箱放 置约 5min，直到细胞基本悬浮起来。

2. 用 1ml ES 培养基中和胰酶的作用，之后把细胞收集到离心管里，1000×g 离心 5min 3. 去掉上清，用预先配制好的预冷的 ES 细胞冻存液来重悬细胞（冻存液的量视冻存的细胞量来定，一般 一个长满的10cm细胞培养皿可以冻存4~6管） ， 按每管1ml的量分装到冻存管中 梯度降温： 4℃20min， -20℃20min，-80℃过夜后迅速转入液氮中 3. 注意事项 1. 丝裂霉素 C 在操作时要避光，避免其分解 2. ES 细胞倾向于聚集生长，因此在复苏时，要选择好培养皿的规格 3. ES 细胞不能长的太满，应避免使各个克隆之间接触，以免发上分化 4. 为避免水或血清带来的污染，对血清应进行支原体检测，配好的培养基要进行污染测试。