载体片段连接技巧.doc

我首先酶切得到带有粘段的载体和目的片段,然后分别补平,再做载体去磷酸化,最后将载体和目的片段连接,转化,可是只可怜昔昔的长出3个单菌落,我还得鉴定正反向,怎么办?平端连接效率真这么低吗?请大家传授自己的经验.欢迎大家以此帖为引展开“平端连接”讨论！ 我曾经作过跟你类似的实验1）目的片段和载体的质量最好高一些2）按照常规连接体系进行，一般20ul体系3））连接温度20-25度由于平端连接不涉及粘性末端的互补，所以温度可以高一些4）酶的用量不要过量，按照说明就可以5）连接时间至少4h，能过夜就过夜6）转化的时候：休克后加入培养基，孵育50min，最多不超过1h，转速不要高，大约150-170rpm然后稍加离心弃去上清，留下大约200ul涂板子就可以了 在我的平端连接试验中，我曾经尝试过将目的片断抽真空变成干粉后，以较小体积重新溶解后再与目的载体连接，我觉得这样效果也不错另外，平端连接反应最好在16度环境中过夜 1) 提高目的片段浓度无论对于粘性末端或者平端连接都是很有促进作用的；2）就连接的温度而言，一般粘性末端选择16C，而平端连接选择20-25C，我特地查了一下，NEB公司的平端推荐温度也是20－25C。

连接的过程中涉及大量个事件：粘性末端突出部分的退火互补；两端序列5'-3'之间在连接酶的作用下进行连接两个事件互相促进在粘性末端连接中，2种因素都起作用但是，连接酶的最佳活性温度是37C，退火互补需要温度降低，连接酶发挥作用需要温度提高，所以就权衡一下，实践摸索16C是粘性末端的最佳连接温度平端连接中，不存在粘性末端那样突出序列要互补的问题，所以要尽可能的照顾连接酶的活性那为什么不用37C？因为这个时候虽然酶的活性较好，但是不利于片段和载体之间的相互碰撞所以，还是选择了20－25C screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=139 height=139 title="Click to view full my.JPG (139 X 139)" border=0 align=absmiddle> 有启发！多谢！ 我的经验是:1， 平端连接需要过夜反应2， 插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍，这个很关键载体通常50ng就够了，若你的载体在10k左右，可用50~100ng.3， 若你的载体很大，建议你用电转化而且电转化前要纯化连接产物。

先谢谢楼上各位的指点，对我大有启发，我再重新做一次，希望能有好的结果还有一个问题请教各位，补平之后，是否需要先回收再去磷？还是补平后直接加BUFFER和CIAP？ 如果补平后回收，然后CIAP，然后再回收，载体处理的更干净，可是会有损失通常我是补平后用纯化试剂盒纯化,之后做CIAP, 然后跑胶回收总之，1： 补平后不可直接做CIAP至少要纯化后再CIAP2： CIAP后一定要跑胶回收处理，因为这是连接前的最后一步，一定要干净 关于平端连接的一点点补充：［优点］没有连不上的，只有切不开的！平末端连接不牵扯到粘性末端的碱基突出问题，所以，理论上任何两条DNA序列都能连接在一起，当然需要ligase的酶学作用了这个不同DNA分子之间的连接带来了极大地便利，因为平末端自然是这样，而如果遇到5‘或者3’突出的粘性末端，也可以经过处理成为平末端另外，有时候，两个平末端连接在一起以后，可以产生另一种内切酶的识别序列，为后续的克隆工作提供了一种机会［缺点］1）连接效率比粘性末端低连接效率之所以比较低，原因之一是在连接过程中只有连接酶的作用，缺乏粘性末端那样突出碱基的互补作用；原因之二是常用的T4DNAligase对于平末端的Km值比粘性末端高1000倍。

2）可能产生双向插入由于平端连接的末端没有特异性，连接的时候不能定向，所以两种方向的插入都有可能这个时候就需要有一种有效的鉴定方法一般分别在载体和目的片段选择一个酶切位点进行酶切鉴定，当然，具体的鉴定方法要根据具体的实验而定3）可能多拷贝插入平端连接时，可能目的片段多个插入，并且在多个插入的时候还有可能每个插入子以不同方向连接，导致有时候结果难以解释一般目的片段越大，多拷贝插入的可能就越小 各位大侠：我现在在做三段连接，两段目的基因中一个用EcoRI和BspTI双酶切，有1.8Kb；另一个基因为100bp的片断，用NotI和BspTI双酶切载体大片段用EcoRI和NotI双酶切，将他们放入一个连接体系里面连接，结果什么也没转化出来！！！郁闷啊！！！请问各位，怎么安排两个目的片段的比例？我用的酶是晶美的MBI的酶，而宝生物说我的BspTI酶切虽然是粘端，当时连接效率低，要用平端的连接条件，请问对于粘端采用平端条件应该怎么做呢？？我是新手，希望各位前辈不吝赐教！！！！！还有，我如果先将两个目的片段连接，再和载体连接，那样效率是不是会高点呢？To mybbff：你以前做成功三段连接，你用的体系大概是什么？我的目的片断是100微升PCR产物 纯化为40微升，再全部酶切后，纯化用15微升TE溶解，你看这个浓度做三段连接够了吗？现在真是很郁闷！找不到原因，不知道该怎么改进！！！！希望你能多给些建议！！！不甚感激！！！！ >To：yywwrm 1）实验中没有什么是死的，都需要具体的去摸索。

2）DNA浓度越高，分子末端的碰撞几率越高，连接的成功率越高但是，DNA末端之间也存在竞争，所以DNA的浓度对于连接产物的形成也有很重要的影响3）建议适当提高小片段浓度，适当降低大片段浓度4）我的做法是，如果有下一步工作（除了转化），DNA最好不用TE溶解，而是用55C预热的DDW溶解5）实在不行，可以先连接其中一个目的片段，再连接第二个目的片段，分步作，可能成功率高一些这样如果多克隆位点不方便的话需要利用中间载体进行倒换Good luck! screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=139 height=139 title="Click to view full my.JPG (139 X 139)" border=0 align=absmiddle> 谢谢你！！mybbff！！！你说的先连接其中一个目的片段，再连接第二个目的片段，分步作，是不是就是先把一段载体克隆进我的表达载体然后再把另一段基因克隆进去？室这个意思吗？？ yywwrm wrote:谢谢你！！mybbff！！！你说的先连接其中一个目的片段，再连接第二个目的片段，分步作，是不是就是先把一段载体克隆进我的表达载体。

然后再把另一段基因克隆进去？室这个意思吗？？你说你是三片段连接，那么就是2个目的片段和1个载体我的意思是你也可以这样做：1）把目的片段1连入载体A，构成重组质粒B，然后把你的目的片段2连入重组载体B，就构成了你最终需要的质粒C那么在质粒C中就同时含有你的2个目的片段2）但是，我猜测你之所以要用三片段连接，可能上面那样做多克隆位点不方便，那么你可以先按照上面说的把目的片段1和2分别克隆到其他一个合适的载体，然后把1和2一起再亚克隆到你最终要用的那个载体也就是中间转换一下载体不知道你明白了没有？ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=139 height=139 title="Click to view full my.JPG (139 X 139)" border=0 align=absmiddle> 你的意思我明白！谢谢啦！！我再试几次，刚两了一次，呵呵！如果再不行就只能换方法了！！！ 1.平端连接用宝生物的酶需要16度用NEB的酶22度过夜反应2. 插入的DNA片段的摩尔数是载体摩尔数的3-10倍，这个很关键，10K载体通常50ng-100ng就够了。

3. 热激转化要比电转化的效率大10倍，有条件的建议用电转化 4.载体酶切后跑胶回收，CIAP后只要用氯彷处理回收即可 spring333 wrote:3. 热激转化要比电转化的效率大10倍，有条件的建议用电转化 4.载体酶切后跑胶回收，CIAP后只要用氯彷处理回收即可3. 逻辑不对吧？4. 载体酶切后，如果切掉的是一个大片段，应该电泳回收；如果切掉的只有几个碱基，完全可以利用纯化柱子回收，更快；CIAP处理后，最好不要用氯仿处理回收，一样可以利用纯化柱子去除蛋白回收，更快，更方便，更重要的是避免了氯仿处理不好对后续试验造成的可能影响 推荐：使用PCR上使用温度循环连接，其实温度高的时候DNA分子热运动剧烈，并不利于连接；温度低的时候ligase的效率又降低！所以推荐使用高浓度的ligase、PEG、和温度循环连接！具体可以大家可以查查，我记得是这样，时间长有点忘了！ 看了上面各大侠的经验，的确有所启发，但是我有自己的一些TRICK，屡试不爽！请指教A. 如果是先补平或切平粘性末端再连接，效率不会高，主要是因为补平或切平的效果不好，得到的转化子多是自连，本人的方法是，先用Klenow酶处理，马上再用T4聚合酶处理，这样处理得到的平端几率较高B. 连接酶的处理温度每个公司并不一样，要参照各公司的说明书，我一般用Promega的，效果不错，16度过夜，注意酶、片断浓度要高，载体浓度可以低一点C. 我个人认为CIAP处理后最好用苯酚氯仿纯化，因为CIAP会跟DNA末端紧密结合，光靠凝胶回收是去不掉的，它会极大影响后面的连接。

可能你会觉得最后的得率很低，不过请放心，只要小心点，沉淀下来得核酸足够做克隆最后给大家我的完整平端连接步骤：（以20ul 酶切完后的体系为例）1如果要补平或切平请先将样品置于70度水浴10min，然后体系放大到50ul，其中按照说明书加入所需klenow buffer和酶，以及BSA等常温反应10min后将反应物置于37度水浴，再加入T4聚合酶，反应5min凝胶回收处理的载体或片断3CIAP处理4苯酚氯仿纯化，最后乙醇回收5连接反应祝大家平端连接成功！ 有没有设对照？在做正式的连接转化之前或者同时，要先做阴性阳性对照如果阳性（质粒）对照不长或数量比较有限，说明感受态有问题，或者是转化技术，或者培养基但感受态的质量是最值得关注的即使质粒对照长得过得去，对于做你这个连接也不一定能满足要求很重要啊如果是阴性对照（只有处理好的载体，没有加片段长了菌，而且长的和你的正式实验组数量没有很明显的差别，那你根本不用费力去做鉴定了这是在之前的环节出了问题：酶切不完全；跑胶没有跑开； 连接酶的质量一定要好，PROMEGAR和NEB（有个五分钟快速连接试剂盒我用过还可以）都较好，如果有罗式的快速连接试剂盒那更好了，但要1500块，而且要等个把月才能到货。

另外，我们实验室的牛人说平端连接可以在16度若干小时或过夜，然后低温（4度）长时间（22小时左右）再转化我没有这样做过，但我觉得你可以考虑试试尽量把各个环节优化吧，剩下的就是多尝试了真做不出来也是可以理解的祝你好运！！ 我做过这个类似的连接的,我是目的片断用大K片断补平,然后电泳回收.载体就直接酶切回收.我没有进行去磷酸化.在16度过夜连接,总体系12微升,其中1微升T4酶.当然目的片断和。