谷胱甘肽含量测定.doc

植物生理学模块实验指导李玲 主编科学出版社还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）【实验目的】了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法实验原理】谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量器材与试剂】1. 实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计2. 实验试剂50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解稀释至100ml再称取186mg Na2-EDTA·2H2O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。

0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存现用现配100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg 还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml3. 实验材料同抗坏血酸实验步骤】1. 标准曲线制作取6支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min以0号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线项目试管号012345100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.200.1mol/L pH7.7磷酸缓冲液/ml1.01.01.01.01.01.04mmol/L DTNB试剂/ml0.50.50.50.50.50.5相当于还原型谷胱甘肽物质的量/μmol0204060801002. 提取取材后，称取2.5g样品置于研钵中，加入5ml经4℃预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）,在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4℃、12000g离心20min。

收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积3. 测定取1支试管，依次加入1ml蒸馏水、1ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.7）和0.5ml 4mmol/L DTNB荣毅仁，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液以此溶液作为参比，在波长412nm处对分光光度计进行调零另取2支试管，分别加入1ml上清液、1ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）向一支试管加入0.5ml 4mmol/L DTNB溶液，另一支试管中加入0.5ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.8），将两支试管置于25℃保温10min按照制作标准曲线的方法，迅速测定显色液在波长412nm处的吸光度，分别记作ODs和ODc重复3次计算结果】n×VVs×m显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度（ODs）和空白对照管反应混合液的吸光度（ODc）根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）=式中，n为由标准曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）；V为样品提取液总体积（ml）；Vs为吸取样品液体积（ml）；m为样品质量（g）。

注意事项】1. 在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量在谷胱甘肽还原酶（GR）作用下，将GSSG还原成GSH再进行测定和计算3. 建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。