ELISA原理及步骤
6页1、ELISA原理一一操作规则(新手适用)点击次数:3347发布时间:2010-7-12 8:45:33ELISA原理一一操作规则(新手适用)酶联免疫吸附实验 ELISAELISA 法是免疫诊断中的一项新技术,现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传 染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量 测定,根据已经使用的结果,认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自 动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份 标本,因此,也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体,而且也可用于测定 体液中的循环抗原,所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域 的应用范围日益扩大,可概括四个方面: 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究 抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。一实验目的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA) 是在免疫酶技术(immunoenzymatic tec
2、hniques)的基础上发展起来的一种新型 的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被,加 待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)待测 抗体(抗原)酶标记抗体的复合物,再与该酶的底物反应生成有色产物。借 助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色 产生成正比。二实验原理用于免疫酶技术的酶有很多,如过氧化物酶,碱性磷酸酯酶,BD半乳 糖苷酶,葡萄糖氧化酶,碳酸酐酶,乙酰胆碱酯酶,6磷酸葡萄糖脱氧酶等。 常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶,碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化 物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定,否则空气中的 氧化作用使颜色加深,无法准确地定量。辣根过氧化物酶(HRP)是一种糖蛋白,每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素 辅基的最大吸收峰是403nm,HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm,所以酶的浓度 和纯度计算式是(已知HRP的A (1cm 403nm 1%)=25,式中1%指HRP百分浓 度为100
3、ml含酶蛋白1g,即10mg/ml,所以,酶浓度以mg/ml计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP 纯度(RZ)=A403nm/A275nm 纯度 RZ( Reinheit Zahl) 值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右,最高可达3.4。 用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。ELISA 的基本原理有三条:(1) 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯 表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;(2) 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能 保持其免疫学和酶学活性;(3) 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定 是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成 正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。三、实验方法基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110ug/ ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml, 4C过夜。次日,弃去孔
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