细胞凋亡形态学观察.pptx

细胞凋亡的形态学观察细胞凋亡（apoptosis）的命名主要是根据 某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树 叶散落般的形态学特征目前对细胞凋亡 的认识正不断得到深化，检测凋亡细胞的 方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定细 胞凋亡的最可靠的方法一、光学显微镜观察凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形 成致密质块，有时可碎裂在HE染色的组织 切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色 增强，并可形成凋亡小体在组织中凋亡细胞 常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞 分离，不引起炎症反应 本方法简便易行，但在细胞密集的组织中对于 改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特 征的指标，具有较强的主观性，重复性差本 方法可用于调亡现象的初步观察，作为分析指 标之一检测方法：细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或 Giemsa染色，在高倍物镜下观察凋亡细胞 的形态改变，结合显微测量工具可作凋亡 细胞计数二、视频时差显微技术（video time-lapse microscopy）本方法用于细胞培养，通过相差显微镜可 动态观察细胞凋亡的变化过程，尤其是观 察细胞表和外形的变化凋胞与基质分离 ，胞体变圆、收缩、出泡，有的细胞拉长 ，出现钉状突起，特续数小时后细胞膜破 裂，细胞溶解，通过连续观察，本方法可 养壑培养中的凋亡细胞，但不能用于病理 组织。

检测方法：收集2×105细胞/ml培胞，置于多孔培 养板，加入凋亡诱导剂，在带有自动摄像 装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态 改变，每隔分钟30秒作序列摄影，连续24 小时如同进进行荧光染色，可参荧光晃 微镜下观察和摄影三、电子显微镜观察关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜 和扫描电镜下的改变，在许我文献中已有详尽 描述凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩 ，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的 碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜下得到最 佳的体现为凋亡细胞判定提供了最可靠的依 据本方法的缺点是样品制作过程较复杂，且 仪器、设备的费用昂贵，较难广泛大量开展由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进 行大量的观察才能观察到典型的凋亡改变还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细 胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到 较多典型的凋亡细胞时，常可见到各阶段 的改变，并可见到较多典型的凋亡小体很 少见到，出现较多的是凋亡初期胞体收 缩、染色质边聚和后期凋亡小体（或整个 凋亡细胞）被吞噬和降解的现象 一些不典型的改变容易被忽略，在观察时 要特别予以注意检测方法：透射电镜标本经戊二醛和饿酸双重固 定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片 ，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观 察。

扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固 定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空 喷金，扫描电镜观察四、流式细胞技术流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光 射特征及荧光参数时行的细胞穿过流式 细胞仪的激光束集点时使激光发生散射， 分析散射光可以提供细胞大小及结构的信 息散射光包括前向散射光和左向角散射 光两种，前向散射光的强度与细胞大小、 体积相产，右向角射光的强度与细胞结构 的析射性、颗粒性（granu-larity）有关细胞凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、 胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性 发生改变早期凋亡细胞主要表现为前向散射 光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映 了细胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎 裂晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射 光均减弱 由于光散射牧场生并非凋亡细胞的特异性指标 ，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以使前向 散射光减弱因此，只有将光散射特性的检测 与荧光参数的检测结合起来才能准确地辨认凋 亡细胞细胞凋亡过程中核酸内切酶在DNA分子核小体 间的降解，导致小分子DNA漏出，核DNA含量 下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可 以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的 Go/G1峰前出现一个亚二倍体峰（xub-G1峰， 即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡细胞。

根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分 率此外，流式细胞术还可以通过测定线粒体 膜的电位、溶酶体质子泵的活性及细胞DNA/ 总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞检测方法：获取密度1×106细胞/ml左右的细胞悬液 ，精洗，固定，荧光染料染色，上流式细 胞仪分析。