斑蝥临床应用及炮制研究.ppt

1斑蝥临床应用及炮制研究2010版《中国药典》饮片标准研究课题中药饮片质量标准平台建设子课题河南中医学院 张振凌 赵丽娜 王一硕 田连起 石延榜 2概述v斑蝥入药始载于《神农本 草经》，为芫青科昆虫南 方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑 小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥体[1]v辛、热；有大毒具有破 血消癥，攻毒蚀疮，引赤 发泡的作用v由于斑蝥素具有毒性，常 引起临床中毒，从古至今 均需要炮制3主 要 内 容斑蝥临床应用研究1斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究3斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究4斑蝥药材及饮片中无机元素比较研究7斑蝥药材及饮片质量标准的研究5碱制法及碱制斑蝥饮片质量标准研究61斑蝥米炒炮制工艺的研究241.临床应用及药理研究v含有的斑蝥素(Cantharidin, C10H12O4)具有较强 的抗肿瘤活性，并且不降低白细胞，同时具有较强 的刺激；是重要的皮肤发泡剂因而具有重要的药 用价值 1.1、治疗癌症 v斑蝥及提取物以及斑蝥素的衍生物等对治疗原发性 肝癌疗效显著，明显优于手术治疗或放疗。

v斑蝥及斑蝥素的衍生物对乳腺癌、食道癌、肺癌、 贲门癌、肠癌、等也有一定疗效 1.2、治疗神经性皮炎、疥癣、瘰疬v 外用刺激皮肤发泡52.药理研究2.1抗肿瘤机制 v斑蝥素及其衍生物，分子量小，易入细胞内，产生细胞毒作用，具有较 强的抗肿瘤作用，作用机制主要有：v抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡；v抑制肿瘤细胞的侵袭和转移；v抑制癌细胞脱氧核糖核酸(DNA)复制，增加放、化疗的敏感性并且具 有免疫增强和升高白细胞作用，这种独特的作用，早期可能由加速骨髓 成熟或释放所致，后期则可能与促造血干细胞的增殖并向粒一单核系祖 细胞不断分化有关 2.2 抗纤维化和抗氧化损伤作用：v不同浓度的斑蝥素均能改变成纤维细胞的形态，抑制细胞增殖，成纤维 细胞数目明显下降，形态变得不规则，排列混乱，代谢产物增加从而 证实斑蝥素能抑制NIH/373细胞的增殖，并且呈剂量依赖性 2.3 抗炎、抗病毒、抗菌、促雌激素样作用6第二部分 斑蝥米炒炮制工艺的研究05版《中国药典》规定米斑蝥的 炮制方法为取净斑蝥与米拌炒， 至米呈黄棕色，取出，除去头、 翅、足斑蝥为毒性中药，该炮制方法较 为笼统，仅靠颜色对炮制程度进 行判断，没有量化具体的工艺参 数，饮片企业很难按此生产出安 全、可控、稳定的产品。

根据传统的炮制 经验，结合现代 炮制设备，量化 斑蝥米炒炮制工 艺的参数，进行 中试生产，制定 SOP，符合中药 现代化的要求 7米斑蝥小批量米斑蝥小批量 生产工艺生产工艺米斑蝥中试米斑蝥中试 生产工艺生产工艺米斑蝥标准操作 规程SOP入锅 温度200℃同时入锅 炒制2～ 4min米呈黄棕色、米斑蝥完好红外测温仪 滚筒 内壁 温度 300℃铁锅电加热炒药机大米炒制2min后， 入斑蝥炒制3min8v米炒斑蝥SOPv1 适用范围v本标准适用于饮片车间生斑蝥、米炒斑蝥的操作v2 职责v操作工：严格按本SOP进行生斑蝥、米炒斑蝥操作v3 内容v3.1 生斑蝥、米炒斑蝥前的准备v3.1.1称量器具、红外测温仪、电热炒药机等处于完好、清洁状 态，生产用具齐全v3.1.2工作间压差、温度、相对湿度符合生产工艺要求v3.1.3以上要求均满足后，方可生产v3.2 领料 v操作人员领取斑蝥、大米，核对品名、数量等如有不符，严 禁进入生产岗位，并按相关规定处理v3.3 净制：v操作人员将斑蝥过2号筛，筛除杂质，去除头、足、翅，即为生 斑蝥v3.4 称量：v称取生斑蝥（除头、足、翅）250g, 根据生斑蝥每10kg用大米 2kg，称取大米50g。

v3.5 米炒：v将电热炒药机温度设定在400℃，开机，用红外测温仪监测滚筒 内壁底温度，待滚筒内壁温度升至300℃，立即投入大米，并开 始计时，将大米炒2min后立即投入生斑蝥，继续炒制3min，停 止炒制，立即出锅，此时大米为棕黄色，放凉拣去大米炒 制过程共5min，用红外测温仪监测滚筒内壁温度范围在280℃- 320℃v3.6 称量：称重米斑蝥，计算收率v3.7 包装：将米斑蝥定量包装，贴上标签，注明品名、批号、 生产日期等v3.8 清场：生产操作完毕，及时清场，将垃圾妥善处理，确保 现场没有残留物 米炒斑蝥SOP9验证由浙江中医药大学中药饮片厂生产出9批 样品，说明本操作规程可行 10第三部分 斑蝥药材及饮片中斑蝥素含量研究近年来相继 有多篇文章 报道了采用 HPLC法测定 斑蝥素含量 缺点：准确 度不高，重 现性差，使 用不普及建立斑蝥 素的HPLC 含量测定 方法 2005版药 典收载斑 蝥素的含 量测定方 法为GC法11斑蝥不同部位及米炒炮制前后斑蝥素含量比较研究 药材 v大、小净斑蝥 根据大小斑蝥的特征进行挑拣，分档，除去杂质 ，其中一份除去头、足、翅，即为大、小生斑蝥。

粉碎成粗粉， 备用v头、足、内外翅 因小斑蝥饮片的头、足、内外翅不易剥离， 故选大斑蝥进行各部位的剥离，粉碎成粗粉，备用v米炒斑蝥 取净斑蝥与米置锅内，用文火加热，拌炒至米呈黄棕 色，取出，去米每100g斑蝥，用米20g规定药材温度110℃， 加热2min粉碎成粗粉，备用12斑蝥各部位重量比例表样品头重%足重%内翅 重%外翅重 %头、足、翅总 重%胸腹部 重% 15.808.271.9513.1929.2169.62 25.819.161.5810.2526.8071.82 36.197.362.2712.6328.4570.52 45.637.351.7410.2624.9874.31 55.428.381.7810.2225.8073.79 67.3911.242.2611.3332.2266.79 77.968.172.3111.8930.3367.88 平均重量 比例%6.318.561.9811.4028.2670.6813含量测定结果斑蝥中头足翅总重仅占 28.26%，而其所含斑蝥素在 生品中占0.16%，且头足翅很 难完全粉碎，临床不去头足 翅易引起病人恶心呕吐，故 可以认为其为非药用部位。

通过比较可知，斑蝥素 含量：生斑蝥饮片〉斑蝥药 材〉米炒斑蝥这说明米炒 炮制使斑蝥中的斑蝥素含量 减少，毒性降低，同时由于 头足翅中斑蝥素含量较低， 导致同等重量下斑蝥药材中 的含量低于生斑蝥饮片中斑 蝥素含量 南方大斑蝥和黄黑小斑 蝥中斑蝥素含量相差不明显 ，故可将两者一起炮制 14第四部分 斑蝥药材及饮片中总斑蝥素含量研究文献报道认为芫菁科豆芫菁属、斑芫菁属昆 虫中含有的斑蝥素分为游离和结合两部分， 并且总斑蝥素远远高于游离斑蝥素的含量 《05版药典》 规定的氯仿直 接浸提法，没 有得到总斑蝥 素的含量 结合斑蝥素在 酸水解条件下 还原为游离的 斑蝥素通过预试验，证明斑蝥中不仅含有氯仿浸提的 游离斑蝥素，还含有酸水解提取的结合斑蝥素 药材及饮片中 总斑蝥素的研究15☞总斑蝥素提取方法的考察0.5mol/LH2SO4溶 液调PH至2左右样品粗 粉0.4g蒸馏水10ml 提取液上清液离心70℃水浴 加热30min酸液至分液漏斗至蒸发皿50℃水浴挥干甲醇定容至5ml容量瓶超声15min氯仿萃取4次第一 法16超声处理15分钟 静置26h样品粗 粉0.4g三氯甲烷10ml提取液至分液漏斗至蒸发皿50℃水浴挥干甲醇定容至5ml容量瓶盐酸溶液（PH=1）10ml氯仿萃取4次静置26h超声处理15分钟第二法第三法第四法17结果 将上述四种方法所得供试品溶液，按色谱条件进样， 计算各样品中总斑蝥素的含量。

提取方法第一法第二法第三法第四法 总斑蝥素含量 （%）1.371.601.601.61为使斑蝥素转移完全，对该法中三氯甲烷的萃取次数 及洗涤次数进行考察，结果表明，萃取五次和洗涤五次转 移完全 按照该法对药渣进行提取，提取液中未检测到斑蝥素， 表明提取完全18☞☞第四法正交设计实验考察水平因素A盐盐酸PHB超声功率(W)C 超声时间时间 （min）D 三氯氯甲烷烷用量 （ml） 1 2 3PH=1 PH=2 PH=3300 400 50010 15 2010 20 30因素水平表 通过预试验，分别对盐酸PH值、超声功率、超声时间 、三氯甲烷用量四个因素，选用L9（34）正交试验表对酸水 解超声法提取工艺进行筛选优化 19总斑蝥素提取方法L9（34）正交实验及实验结果 实验 号因 素总斑蝥素含量 （%）A盐盐酸PH 值值B超声功率 (W)C超声时间时间 （ min）D三氯氯甲烷烷用量 （ml） 11 (PH= 1)1(300W)1(10min)1(10ml)1.32212(400W)2(15min)2(20ml)1.29 313(500W)3(20min)3(30ml)1.51 42 (PH= 2)1231.43522311.00 623121.31 73 (PH= 3)1320.39832130.44 933210.41 K14.12 3.14 3.07 2.73 K23.74 2.73 3.13 2.99 K31.24 3.23 2.90 3.38 Sj1.63 0.05 0.01 0.07 总和9.20 9.20 9.20 9.20 9.1020方 差 分 析 表 方差来源离差平方和自由度均值F值值显显著性 A1.6321 2 0.8160 172.00 ** B0.0474 2 0.0237 4.99 D0.0714 2 0.0357 7.52 误差C0.0095 2 0.0047 综合考虑确定总斑蝥素最佳工艺为：A1B2C2D1。

即：取三氯甲烷和 PH=1的盐酸溶液各10ml，超声 处理（功率100W，频率40kHz）15分钟 21☞☞验证分别取同批次斑蝥药材样品粗粉0.3g各3份，精密称 定，按优选的提取工艺提取总斑蝥素，结果得各批次含量 的相对平均偏差为0.76%，证明总斑蝥素采用此提取工艺 提取可行斑蝥素是一种酸酐，能与体内的Na,Mg等金属元素结合，形成斑蝥 素钠盐或镁盐等这些斑蝥酸的结合物在酸性环境中能够游离出斑蝥 酸或者斑蝥素，故采用酸水解的方法提取总斑蝥素实验过程中发现斑蝥药材粉末总是在酸水层，不在氯仿层，故可 以采用萃取的方式分取氯仿层提取液并采用正交实验设计优选出总 斑蝥素的提取工艺 22斑蝥不同部位及米炒前后总斑蝥素含量比较研究 药材 斑蝥药材、米炒斑蝥及斑蝥头、足、内外翅部分样品 同“第二部分实验3中样品”供试品溶液的制备按照实验1中优选提取工艺制备色谱条件 流动相：甲醇－水(23:77)， 流速1.0ml/min，检测波长230nm，柱温：30℃精密称取斑蝥素对照品2.18mg，置2ml容量瓶内，少量甲醇 超声使溶解后，加甲醇至刻度，摇匀，备用 对照品溶液的制备23含量测定结果斑蝥中头足翅总重占 28.2%，而其所含总斑蝥素 占0.61%，含量较低，进一 步证明其为非药用部位。

通过比较可知，总斑 蝥素含量：生斑蝥饮片〉 斑蝥药材〉米炒斑蝥与 其斑蝥素含量趋势一致 这说明米炒炮制不但 使斑蝥素含量减少，而且 总斑蝥素含量也减少，推 测结合斑蝥素的存在 24第五部分 斑蝥药材及饮片质量标准研究本次质量标准的制定，共收集斑蝥药材16批次，生斑蝥10批次，米炒斑蝥15批次经河南中医学院生药学科陈随清教授鉴定分别为芫青科昆 虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas 或黄黑小斑蝥 Mylabris cichorii Linnaeus 的干燥体、去除头足翅及杂质的 净制加工品或米炒炮制加工品 实验1.样品的收集与鉴定 25编号样品名称规格等级批号产地样品重 g提供单位1斑蝥大小混装Y080822贵州200浙江。