《高三生物复习资料》实验1-大肠杆菌的培养和分离

1、选修1 生物技术实践,微生物的利用,酶的应用,果酒的制作,泡菜的腌制,植物组织培养,选修1 生物技术实践,实验1 大肠杆菌的培养与分离 实验2 分离以尿素为氮源的微生物 实验4 果汁中的果胶与果胶酶 实验6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测 实验8 果酒及果醋的制作 实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定 实验11 植物的组织培养,浙科版,人教版,第一部分 微生物的利用,一、微生物的类群,微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。,大约有10万种微生物，多数微生物对人类是有益的！,任务1：请将中学阶段涉及的微生物进行分类。,T2噬菌体、烟草花叶病毒、流感病毒、HIV病毒、劳氏肉瘤病毒 大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌、醋酸杆菌、 肺炎双球菌、霍乱弧菌、幽门螺旋菌、放线菌、 支原体、蓝细菌、酵母菌、青霉菌、黑曲霉、 食用菌 草履虫、变形虫、伞藻、绿藻、金鱼藻、衣藻、,结构,细胞壁 细胞膜 细胞质 拟 核,特殊的结构,二、细菌单细胞原核生物,形态：杆形、球形、弧形、螺旋形,荚膜 鞭毛 芽孢,主要成分是肽聚糖，可被某些溶菌酶水解

2、，青霉素能抑制其合成。,唯一的细胞器：核糖体。 质粒：小型的环状DNA分子，控制抗药性等性状。,由一个大型的环状DNA反复折叠缠绕而成,控制着细菌的主要遗传性状。,细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆性很强的休眠体、具厚壁，以度过不良的环境。,主要成分为多糖，与其致病性有关。,由蛋白质组成，与运动有关。,（主要以二分裂方式进行）,细菌的繁殖方式,菌落可以作为菌种鉴定的重要依据。,菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖形成的肉眼可见、有一定形态结构的细胞群。 单菌落：单个细菌在固体培养基上大量繁殖形成的独立的单个菌落。,细菌的鉴定菌落和单菌落,异养需氧型 异养厌氧型 自养需氧型 自养厌氧型,大多数细菌的代谢类型属于什么方式 ? 在生态系统中处于什么地位 ?,分解者或消费者,生产者,菌落在生态学上属于什么单位 ？,大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。,实验1 大肠杆菌的培养和分离,由于易培养、繁殖快，被广泛用于基因工程。如何扩大培养？如何从可能污染的菌群中分离大肠杆菌并保存？,革兰氏染色：细菌经紫色的革兰氏染液染色后，再用酒精脱色，可把细菌分为两大类：仍被染成紫色的即为革兰氏阳性菌(

3、G+)和脱去染色的为革兰氏阴性菌(G-)。这两种细菌的差别在于细胞壁的成分不同。,知识要点,培养基的分类和成分 无菌技术：消毒、灭菌 两种分离纯化的方法,培养基的分类和成分,根据物理性质分类：,根据培养基的用途分类：,如何分离固氮菌？分离自养型微生物？,培养基的分类和成分,培养基是适合微生物生长繁殖的营养基质，一般包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子。,糖类：葡萄糖、蔗糖、淀粉等；蛋白质、核酸类：牛肉膏、蛋白胨、花生粉饼、明胶、氨基酸等,牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等,酵母提取液、豆芽汁类：维生素、酶、碱基等,蔗糖等有机物,氨基酸等小分子有机物,维生素类,生长素、细胞分裂素,培养不同的微生物，所需成分、酸碱度不同：“细菌喜荤，霉菌喜素”；细菌中性偏碱，霉菌中性偏酸。,灭菌是指用强烈的理化方法 ，杀死一定环境中所有微生物的细胞、芽孢和孢子。,消毒是指用较为温和的理化方法 ，杀死部分微生物，不杀死芽孢和孢子 。,（1）煮沸消毒法（100煮沸5-6min）：一般物品 （2）巴氏消毒法（70-75 煮30min）：不耐高温的液体，如牛奶 （3）化学药剂消毒法（ 70%75%酒精）：擦拭双手,（

4、1）灼烧灭菌法（酒精灯火焰）：接种环，操作时试管口 （2）干热灭菌法（160-1701-2h）：其他金属工具 （3）高压蒸汽灭菌法（1kg/cm2的压力下，12115min ）：培养基及试管、培养皿、三角瓶等。如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，可在90以上(500g/cm2压力)的高压蒸气锅中灭菌30min。 （4）紫外线和过滤风灭菌：超洁净工作台 （5）过滤灭菌法（G6玻璃砂漏斗）：尿素溶液,无菌技术：消毒、灭菌,无菌操作的要求: (1)各种器皿必须是无菌的 (2)各种培养基必须是无菌 (3)转移操作的过程及其它环境也应是无菌的,为什么要灭菌？,若混有杂菌，将与菌种形成竞争关系，影响菌种的生长或不能分离到所需的微生物。,在培养微生物时必须进行无菌操作。,培养基的配制,高压蒸汽灭菌,称量,溶化,调pH,分装,大肠杆菌的LB液体培养基,步骤1：大肠杆菌的LB培养基配制及相关器具和培养基的灭菌,加封口膜,超净台灭菌,酒精消毒桌、手,酒精灯旁操作,步骤2：细菌以“二分裂”的方式繁殖，约20min分裂一次，在液体培养基进行扩大培养。 步骤3：用划线分离法进行分离纯化。,LB固体培养基

5、需加琼脂1克。 计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。,步骤4：划线分离法需要制作固体培养基（倒平板）。,超净台的环境下操作！ 在冷却到60时倒平板！,两种分离纯化的方法：划线分离法，涂布分离法,划线分离法,1、划线分离法,方法：用烧红后冷却的接种环蘸取带菌的液体培养物，在固体培养基的平板上划线。,原理：微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,2、涂布分离法,方法：将培养的菌液稀释，通常稀释10-510-7倍。取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基的平面上，然后进行培养。 在某个稀释度下，可培养得到相互分开的菌落，通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。,划线分离法：方法简单。 涂布分离法：单菌落更易分开，但操作复杂些。,单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。,划线分离法,涂布分离法,实验小结操作细节的思考,一、实验内容 1、用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌。 2、在固体平面培养基上划线进行分离。,二、操作细节 1、倒平板时，为什么需使锥形瓶瓶口通过

6、火焰？接种操作为什么要在火焰旁进行？,空气中存在有大量的微生物，而接种灯的火焰旁能形成一个无菌的区域，在这里操作，可以避免杂菌的污染。,2、如何使接种环冷却后再挑取菌体？为什么要冷却？,让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却。以免接种环温度太高,杀死菌种。,3、为什么在划线分离法操作时，第一步要灼烧接种环？,为了避免接种环上可能存在的微生物造成污染。,4、若用分离划线的方法，为什么每次划线前都要灼烧接种环？,为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使一次划线时，接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目减少，以便得到单菌落。,5、为什么在划线操作结束时仍需灼烧接种环？,及时杀死接种环上残留菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。,6、进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?,恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸汽所凝结的水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。则菌落中的菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。,在酒精灯火焰旁，将单菌落用灭菌的接种环取出，用划线法接种在斜面上，37恒温培养箱中培养24h后,置于4 冰箱中保存。,7、分离纯化后的大肠杆菌如何保存?,9、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理?,所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。,8、接种斜面画线时要注意什么？,(1)由里向外画，(2)线条要细且密；(3)不要重复划线，(4)不要画破培养基，不要接触到管壁或管口。,下列关于微生物培养基的说法中，正确的是 A.同一种物质不可能既作碳源又做氮源 B.凡是碳源都能提供能量 C.除水以外的无机物仅提供无机盐 D.无机氮也能提供能量,解析：对于异养微生物来说，含CHON的有机化合物既是碳源，又是氮源；CO2是光能自养细菌的碳源，但不能直接提供能量；CO2和N2是自养微生物的碳源和氮源；硝化细菌所利用的氮源是氨；同时氨也能提供化能合成作用的能源。,

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