浅析罗丹明123分离的肝癌细胞系mhcc97亚群afp的表达
8页1、从本学科出发,应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性,便于研究生提出新见解,特别是博士生必须有创新性的成果浅析罗丹明123分离的肝癌细胞系MHCC97亚群AFP的表达 【摘要】 目的: 应用罗丹明123结合流式细胞术对人肝癌细胞MHCC97进行分选, 检测甲胎蛋白(AFP)在不同肝癌细胞亚群中的表达差异。方法: 应用罗丹明123结合FCM将人肝癌细胞株MHCC97分为Rholow和Rhohigh组, 采用免疫细胞化学方法观察AFP表达和含量。结果: Rholow组和Rhohigh组比较, AFP表达率有显著性差异。结论: AFP在肝癌细胞亚群中表达有差异, Rho123结合FCM可以进一步证实肿瘤的异质性。 【关键词】 肝细胞癌 异质性 罗丹明123 恶性肿瘤虽然是从一个发生恶性转化的细胞单克隆增殖而来的, 但在生长过程中, 可能出现其生长速度、 侵袭能力、 对生长信号的反应、 对抗癌药物的敏感性等方面的差异, 而这种异质性的特点正是恶性肿瘤容易复发及产生耐药性的根本原因1。瘤细胞异质性及其所导致的肿瘤细胞的生物学行为的改变, 对了解肿瘤细胞的生物学特性和指
2、导临床有重要意义。近年来, 利用流式细胞术检测可以获得组织中具有原始干细胞特征的成体细胞, 利用类似的方法可以将肝癌细胞分成2个不同特性的亚群, 从而获得具有原始干细胞特性的成体细胞。甲胎蛋白(AFP)是肝癌特异性最强的标记物, 但是也存在异质性, 临床上常遇到良性肝病的AFP值明显增高或是原发性肝癌AFP值偏低。AFP在肝癌组织中的差异表达有可能反映了肝癌组织中不同癌细胞在分化程度上的差异。我们应用罗丹明123结合FCM对肝癌细胞系MHCC97分选为Rholow细胞及Rhohigh亚群, 并对各亚群对AFP进行差异性比较。 1 材料和方法 材料 MHCC97肝癌细胞(人高转移肝癌细胞系)由上海复旦大学中山医院肝癌研究所提供; DMEM培养基、.5g/L胰酶为Gibco公司产品; 小牛血清为四季青公司产品; Rho123为Sigma公司产品; 小鼠抗人AFP单克隆抗体、 羊抗小鼠IgG二抗免疫组化及DAB显色试剂盒为北京中杉公司产品; DEPC水为Sigma公司产品; Rnase抑制剂、 随机引物及MMLV逆转录酶为Promega公司产品; AFP引物为北京三博远志生物技术公司产品;
3、琼脂糖、 Taq DNA聚合酶、 FACS Aria流式细胞分选仪为美国BD公司产品; BX51荧光显微镜及DP70数字图像摄影系统为Olympus公司产品; FR980A生物凝胶电泳图象分析系统为复日公司产品。 方法 不同浓度Rho123染色的Rholow及Rhohigh细胞的分析 MHCC97细胞常规消化, HBSS洗涤, 制备成单细胞悬液, 细胞密度为1105/L。等分细胞悬液, 参考Rho123对线粒体膜电位测定的浓度( mg/L), 分别做 mg/L和/L2个浓度梯度, 对照组加入维拉帕米, 以未加Rho123作为阴性对照,7避光水浴30 min, 冰上min终止染色, 冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬。480 nm激发光源, 检测FITC通道, 对数模式采集信号做一维散点图, 将低Rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为Rholow细胞的“门”。 Rholow及Rhohigh细胞的分选 细胞染色: MHCC97细胞常规消化, HBSS洗涤, 制备成单细胞悬液, 细胞密度为1106/L。等分细胞悬液,组均加入荧光染料Rho123根据上一步结果选择合适终浓度, 其中1组再加入维拉帕
4、米, 终浓度50 mmol/L,7避光水浴30 min, 冰上min终止染色, 冰预冷HBSS洗涤细胞并重悬。FCM检测分选:80 nm激发光源检测, 对数模式采集信号做一维散点图, 将低Rho123且维拉帕米组缺失的区域设定为Rholow细胞的“门”, 计算百分比, 分选出Rholow细胞及Rhohigh细胞。 AFP免疫细胞化学分析 采用SP方法, 操作步骤参照SP试剂盒说明。AFP mAb工作浓度1100, DAB显色, 苏木精复染。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。胞质出现棕黄色颗粒定为阳性, 根据阳性细胞百分率分为: 阳性细胞50%为(+)。 统计学处理 统计软件包分析, 采用非参MannWhitney两独立样本秩和检验。 2 结果 .1 Rholow及Rhohigh细胞的分析 1 mg/L和/L组单纯加入Rho123组几乎无低荧光拖尾, 加入维拉帕米无明显改就; mg/L组有一低荧光拖尾, 而维拉帕米拮抗组此区有改变; /L组同样有一低荧光拖尾, 而维拉帕米拮抗组此区有明显改变, 该区比例为%, 分别选取此浓度作为分选浓度(图1)。 图1 Rholow及Rhohigh细胞
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