土壤酶活活性测定方法
9页1、土壤脲酶(urease)活性的测定方法:靛酚比色法(一)方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质,酶促水解生成的氨与酚类化合物起 反应生成蓝色的靛酚,颜色深度与氨含量相关,因而用于脲酶活性的测定。(二)试剂1)甲苯2)10%尿素:称取10g尿素,用水溶至100mL。3)柠檬酸盐缓冲液(PH6.7):184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将 两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升。4)苯酚钠溶液(1.35mol/L): 62.5克苯酚溶于少量乙醇,加2毫升甲醇和 18.5毫升丙酮,用乙醇稀释至100毫升(A),存于冰箱中;27克NaOH溶于 100毫升水(B)。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合, 用蒸馏水稀释至100毫升。5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。6)氮的标准溶液:精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL,得到 1mL含有0.1mg氮的标准液。(三)测定步骤(1)标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL,定容至100mL,即稀释了 10倍,吸取1,3, 5,7,9,11,
2、13mL移至50mL容量瓶,加水至20mL,再加入4mL苯酚钠,仔细混合,加入3mL次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色 液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标, 以光密度值为纵坐标绘制曲线图。(2)土壤中脲酶活性的测定称取10 g 土壤置于100mL容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中 加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液(pH6.7)。仔细混合后,将瓶放 在37C。恒温箱中,放置3 h。与此同时,进行以水代替基质,及无土壤的基质对 照测定。培养结束后,用热至38C的水稀释至刻度。摇匀,将悬液过滤。吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中,用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入 苯酚钠等试剂,显色,比色,最后根据标准曲线求出氨态氮含量。以每克土壤在37C下24h内酶解尿素释放的NH3-N的毫克数来表示脲酶活 性。土壤蛋白酶活性测定方法:铜盐比色法(一)方法原理本法基于以精胶为基质,酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复 合物。用比色测定颜色深度,计算出氨基酸含量,来度量酶的活性。(二)试剂1) 1%精
3、胶2)甲苯3) 铜-磷酸盐溶液: 27.3g CuCl2H2O 溶于 1 L 水;64.5g Na2HPOj 12H2O 溶于 500mL 水,加入 7.2g NaOH,稀释至 1L ;57.21g Na2B4O7溶于 1.5L 水, 加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L,使用按照1:2:2的体积分数前将上述 、混合。4) 甘氨酸标准溶液的配制:取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水,稀释至1 L (1mL 含 50|ig NH3-N)O(三) 操作步骤(1)标准曲线绘制取0、5、10、15、20 mL甘氨酸标准溶液,用蒸馏水加至20 mL,然后加 入20 mL新配制的铜-磷酸盐溶液。显色后,用分光光度计在650nm处测定, 绘制标准曲线。(2) 土壤蛋白酶活性测定称取5g 土壤置于100mL三角瓶中,加入甲苯2mL,放置15 min,加入 20mL 1%精胶溶液,于37C恒温培养24h,于此同时,以水代替基质作为对照。培养结束后,将悬液过滤,取10mL滤液,加水10mL,铜-磷酸盐溶液20mL。 显色后,用分光光度计在650nm处测定,根据标准曲线求出NH3-N含量。以每克土
4、壤在37C下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量(pg)表示蛋 白酶活性。土壤磷酸酶测定方法:磷酸苯二钠法(一)方法原理本法基于以磷酸苯二钠为基质,酶解释放出的酚,使其与氯代二漠对苯醌亚 胺试剂反应生色。用比色法测定出游离的酚量,用以表示磷酸酶活性。(二)试剂配制1)0.5%磷酸苯二钠(用缓冲液配制);2)pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液;3)氯代二溴对苯醌亚胺试剂:取0.125g 2,6-二漠苯醌氯酰亚胺,用10mL 96%乙醇溶解,贮于棕色瓶中,存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均 可使用;4)酚的标准溶液:酚原液取 1g重蒸酚溶于蒸馏水中,稀释至1L,贮于棕色瓶中;酚工作液取 10mL酚原液稀释至1L (每毫升含0.01毫克酚);5)甲苯;6)0.3%硫酸铝溶液。(三)操作步骤(1)标准曲线绘制取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液,置于50mL容量瓶中,每瓶加 入5mL缓冲液和4滴氯代二漠对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至刻度,即得0.0002、 0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022 和 0.0026mg
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