土壤酶活活性测定方法

土壤脲酶（urease）活性的测定方法：靛酚比色法（一）方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，酶促水解生成的氨与酚类化合物起 反应生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，因而用于脲酶活性的测定。（二）试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100mL。3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将 两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）： 62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和 18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于 100毫升水（B）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合, 用蒸馏水稀释至100毫升。5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。6）氮的标准溶液：精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL，得到 1mL含有0.1mg氮的标准液。（三）测定步骤（1）标准曲线绘制吸取配置好的氮溶液10mL，定容至100mL，即稀释了 10倍，吸取1，3， 5，7，9，11，13mL移至50mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠，仔细混合，加入3mL次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度。将着色 液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标， 以光密度值为纵坐标绘制曲线图。（2）土壤中脲酶活性的测定称取10 g 土壤置于100mL容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中 加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液（pH6.7）。仔细混合后，将瓶放 在37C。恒温箱中，放置3 h。与此同时，进行以水代替基质，及无土壤的基质对 照测定。培养结束后，用热至38C的水稀释至刻度。摇匀，将悬液过滤。吸取1mL 滤液于50mL容量瓶中，用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入 苯酚钠等试剂，显色，比色，最后根据标准曲线求出氨态氮含量。以每克土壤在37C下24h内酶解尿素释放的NH3-N的毫克数来表示脲酶活 性。土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法（一）方法原理本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复 合物。用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。（二）试剂1） 1%精胶2）甲苯3) 铜-磷酸盐溶液： 27.3g CuCl2H2O 溶于 1 L 水；64.5g Na2HPOj 12H2O 溶于 500mL 水，加入 7.2g NaOH，稀释至 1L ；57.21g Na2B4O7溶于 1.5L 水, 加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述 、混合。4) 甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至1 L (1mL 含 50|ig NH3-N)O(三) 操作步骤(1)标准曲线绘制取0、5、10、15、20 mL甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL,然后加 入20 mL新配制的铜-磷酸盐溶液。显色后，用分光光度计在650nm处测定， 绘制标准曲线。(2) 土壤蛋白酶活性测定称取5g 土壤置于100mL三角瓶中，加入甲苯2mL，放置15 min，加入 20mL 1%精胶溶液，于37°C恒温培养24h,于此同时，以水代替基质作为对照。培养结束后，将悬液过滤，取10mL滤液，加水10mL,铜-磷酸盐溶液20mL。 显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。以每克土壤在37C下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量(pg)表示蛋 白酶活性。土壤磷酸酶测定方法：磷酸苯二钠法（一）方法原理本法基于以磷酸苯二钠为基质，酶解释放出的酚，使其与氯代二漠对苯醌亚 胺试剂反应生色。用比色法测定出游离的酚量，用以表示磷酸酶活性。（二）试剂配制1）0.5%磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；2）pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二漠苯醌氯酰亚胺，用10mL 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均 可使用；4）酚的标准溶液：酚原液取 1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L,贮于棕色瓶中；酚工作液取 10mL酚原液稀释至1L （每毫升含0.01毫克酚）；5）甲苯；6）0.3%硫酸铝溶液。（三）操作步骤（1）标准曲线绘制取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加 入5mL缓冲液和4滴氯代二漠对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、 0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022 和 0.0026mgg-1浓度的酚标准溶液梯 度o 30min后比色测定。绘制标准曲线。（2）土壤磷酸酶的测定称取5g风干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，轻摇15min后，加 入20mL 0.5%磷酸苯二钠（酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液；中性磷酸酶用柠檬酸 盐缓冲液；碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液），仔细摇匀后放入恒温箱，在37°C下培 养24ho后于培养液中加100mL 0.3%硫酸铝溶液并过滤。吸取3mL滤液于50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用 硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在风光光度计上于660nm处比色。磷酸酶活性，以37C下24h后1g 土壤中释放处的酚的毫克数表示。土壤蔗糖酶测定方法：3,5-二硝基水杨酸比色法（一）方法原理蔗糖酶酶解所生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨 基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗 糖酶的活性。（二）试剂1）酶促反应试剂：基质5%蔗糖（用pH5.5磷酸缓冲液配制）；甲苯2）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80°C烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于 烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4C保 存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。3）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶）， 接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚 硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL。暗处保存备用。（三）测定步骤（1）标准曲线绘制分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中, 再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min （从试 管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长 540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定称取5g 土壤，置于100mL三角瓶中，加10 mL水、1mL甲苯。摇匀土壤 均匀分散后，放置15分钟，加入15mL5%蔗糖-磷酸缓冲液。摇匀、塞紧，放于 37C。恒温箱中，培养24h。按此操作，用不加土壤的基质和150C。干热灭菌1h 的土壤进行对照试验。培养结束后，用滤纸过滤，取1mL滤液，按绘制标准曲 线方法，测定并由标准曲线其中还原糖含量。土壤蔗糖酶活性，以1g 土壤在37C。时，24h释放出的葡萄糖毫克数来表示。过氧化氢酶测定(容量法)1. 试剂配制a. 0.3%过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释b. 3N硫酸c. 0.1N高锰酸钾(1/5KMnO4)溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2 蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。2. 操作步骤(1) 取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%H2O2溶液。(2) 同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液，而不加土样。(3) 将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，加入5mL3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。 再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。3. 结果计算用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为B，用于滴定25mL原始的过氧化 氢混合液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为A。(A-B)邳即为过氧化氢酶活性。以20min后1g 土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。式中T为高锰酸钾滴定度的校正值。(就是最后换算成每克，所以还要测土壤含水量)高锰酸钾溶液标定称取0.2g (准至0.0001g)于105110C。烘至恒重的基准草酸钠。溶于100mL (8+92)硫 酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液c (KMnO4) =0.1mol/l滴定，近终点时加热至65C, 继续滴定至溶液呈粉红色保持30s,同时作空白试验。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c (1/5KMnO4) =m/ (V1-V2) *0.06700式中 c (1/5KMnO4)二一高锰酸钾标准液之物质的量浓度，mol/L ；m草酸钠之质量，g ；V1高锰酸钾溶液之用量，mL；V2空白试验用高锰酸钾溶液之用量，mL；0.06700与1.00mL高锰酸钾溶液c (1/5KMnO4) =1.000mol/1相当的以克表示的草 酸钠的质量。脱氢酶测定(比色法)取20g 土壤于50ml三角瓶中，加0.2g碳酸钙。混匀后加2ml1%三苯基四唑 氯化物，再加水至最大持水量的90%，在恒温恒湿培养箱中(30C，相对湿度 70%)培养24h。培养结束后，加25ml甲醇，振荡5min,过滤。再用甲醇多次 洗涤漏斗上的土壤，直至获得无色滤液。合并滤液和洗液并定容50ml或100ml, 在分光光度计上于460nm处比色。标准曲线的绘制:吸取10ml分别含20-300微克的三苯基四唑氯化物溶液, 加10mgNaHSO3还原，显色后在分光光度计上于460nm处比色测定并绘制标 准曲线。酶活性表示及计算：以20g 土壤中氢离子的微升数表示。X=av*150.35式中：a1ml滤液中甲醇的毫克数(查标准曲线)V滤液体积（ml）150.35将甲醇量换算成氢的体积（微升）的系数多酚氧化酶活性的测定一一苯三酚比色法（1）标准曲线的绘制取重铬酸钾标准溶液，用0.5mol/LHCl稀释成各种不同浓度。定容后，在分 光光度计上于430nm处比色测定。以光密度值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制 标准曲线。（2）操作步骤称取1g风干土壤样品（过0.25mm筛），置于50mL三角瓶中，然后注入 10mL1%邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30C恒温箱培养2h。取出后加 4mLPH4.5柠檬酸一磷酸缓冲液，再加35mL乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。 最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm 的滤光片，为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用无水乙醇洗涤比色液槽一次。为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食子素的纯 度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。在无基质的土壤的对照中，用水 代替基质进行培养。（3）活性表示紫色没食子素的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。多酚氧化酶活性，以每g干土 2h内生成的紫色没食子素的毫克数表示。