基因工程原理第章外源目的基因表达与调控.ppt

DNA重组（限制性内切酶）运输工具基因克隆载体目的基因的制备目的基因导入受体细胞外源基因的表达外源基因的表达基因工程的应用第六章第六章 外源目的基因表达与调控外源目的基因表达与调控第一节第一节 外源基因表达机制外源基因表达机制DNA转录翻译ATCGAUCG43=64遗传密码氨基酸折叠密码RNA蛋白质转录过程转录过程启动子和调控序列转录的关键原核生物启动子：lac、trp、PR、 Pl等一、外源基因的起始转录外源基因的起始转录二、外源基因二、外源基因mRNAmRNA的有效翻译的有效翻译起始密码子：AUG是首选核糖体结合位点SD序列AGGAGG：至少包含4个碱基SD与AUG之间距离为3-9个碱基翻译起始区不应形成二级结构真核细胞无SD序列，但大多含共同序列：5-CCA(G)CCAUGG-3（1）氨基酸活化和肽链的起始：AA+tRNA+ATPAA-tRNA+AMP+PPi（2）肽链的起始：原核生物：30S+mRNA+AA-tRNA+50S真核生物：40S+ AA-tRNA+ mRNA+60S（3）肽链的延伸：肽基转移酶（4）肽链的终止：终止密码子(UAA、UAG、UGA)和终止因子（5）折叠和加工翻译过程翻译过程氨酰氨酰tRNAtRNAaatRNA+ATP aa-tRNA+AMP+PPi氨酰-tRAN合成酶 氨基酸的活化氨基酸的活化B：延伸：延伸C C：终止：终止 DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。

一、启动子（一、启动子（promoter)promoter)：第二节第二节 基因表达的调控元件基因表达的调控元件 特征特征：序列特异性：不同启动子对RNA聚合酶亲和力不同方向性：53位置特异性：位于调控基因的上游种属特异性：亲缘越近通用的可能性越大转录起始点：通常是一个嘌呤(A或G)Pribnow框，又叫-10区：TATAATSextama框，又叫-35区：TTGACA间隔区（一）原核生物的启动子（一）原核生物的启动子典型的原核启动子有四大要素四大要素：TATAATTATAATTTGACAA/GTTGACAA/GPribnow box5-AGGAGG-3SD序列序列Sextama boxrRNA基因启动子（型）：rRNAmRNA基因启动子（型）：mRNA、部分核内小分子RNA（snRNA）tRNA基因启动子（型）：5SrRNA、tRNA、snRNA（二）真核生物的启动子（二）真核生物的启动子rRNArRNA基因启动子（基因启动子（型）型）核心启动子（核心启动子（core promoter）（-45+20位核苷酸）位核苷酸） 上游调控元件上游调控元件 （-170-107位序列）位序列）（增强转录效率）（单独存在即可起始转录）mRNAmRNA基因启动子（基因启动子（型）型）u没有广泛的同源性u多数含TATA序列,通常处于-30区u无TATA盒的启动子称无TATA盒启动子tRNAtRNA基因启动子（基因启动子（型）型）真核和原核的启动子有很多不同：真核和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）结构不恒定。

有的有多种框盒如组蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期转录蛋白；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNA pol结合转录时先和其它转录激活因子相结合，再和聚合酶结合二、二、 增强子增强子 (enhancer) (enhancer)：增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用特性：双向性重复序列功能与位置无关组织特异性可调控同源基因和异源基因结构基因的增强子 1. 增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10-200倍经人巨大细胞病毒增强子增强后的珠蛋白基因表达频率比该基因正常转录高600-1000倍!2. 增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（53或35），甚至和基因相距3 kp，或在基因下游，均表现出增强效应；3. 大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），是产生增强效应时所必需的； 4. 增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的蛋白质（转录因子）参与才能发挥其功能；5. 没有基因专一性，可以在不同的基因组合上表现增强效应；6.许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。

细胞专一性增强子细胞专一性增强子：许多增强子的增强效应有很高的组织细胞专一性，只有在特定的转录因子(蛋白质)参与下，才能发挥其功能诱导性增强子诱导性增强子：这种增强子的活性通常要有特定的启动子参与例如，金属硫蛋白基因可以在多种组织细胞中转录，又可受类固醇激素、锌、镉和生长因子等的诱导而提高转录水平 三、沉默子三、沉默子(silencer) 是真核基因中的一种特殊的序列，与增强子有许多类似之处沉默子能够同反式因子结合从而阻断增强子及反式激活因子的作用，并最终抑制该基因的转录活性 四、绝缘子（四、绝缘子（insulator） 真核生物基因组的调控元件之一，是一种边界元件绝缘子能够阻止邻近的增强子或沉默子对其界定的基因的启动子发挥调控作用绝缘子的抑制作用具有“极性”的特点，即只抑制处于绝缘子所在边界另一侧的增强子或沉默子，而对处于同一染色质结构域内的增强子或沉默子没有作用转录因子的作用方式：终止子终止子（Terminator）是一段位于基因或操纵子末端的DNA片段，可中断转录作用原核生物拥有两种类型的终止子，包括：本体转录终止子（Intrinsic transcription terminators），一个发夹结构。

依赖转录终止子（Rho-dependent transcription terminators），因子与RNA螺旋酶蛋白复合物五、五、 终止子终止子 (terminator ): (terminator ):（一）（一） 原核生物的终止子原核生物的终止子 -依赖转录终止子依赖转录终止子本体转录终止子本体转录终止子富含GC回文结构：palindrome structure, 双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称回文结构这两个反向重复序列不一定是连续的（二）（二） 真核生物的终止子真核生物的终止子 真核生物终止子，在mRNA前体的近3-端处转录产生一组共同序列，即AAUAAA和GU-rich序列，为转录终止的识别位点和poly(A)修饰识别位点在转录越过修饰点后，RNA链在修饰点处被水解切断，转录终止，随即进行加尾修饰一、大肠杆菌基因表达系统1. 复制子n 常见复制子：pMB1、ColE1、pSC101n松弛型复制子，10-20个拷贝/细胞第三节第三节 外源基因表达与调控外源基因表达与调控（一）大肠杆菌基因表达载体（二）宿主菌1. Lac表达系统表达系统包括正调控系统调控系统和负调控系统负调控系统：CAP因子因子：环腺苷酸(cAMP)与受体蛋白CRP(cAMP receptor protein)结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP(cAMPactivated protein ) ，促进RNA聚合酶结合在启动子上。

正调控系统：调控因子CAP负调控系统：负调控因子lacI R P O S1 S2 DNA调节基因启动基因操纵基因结构基因与阻遏蛋白结合1.RNA聚合酶结合位点2.cAMP及其受体蛋白复合物（cAMP-CRP）结合位点产生阻遏蛋白mRNA操纵子（四）（四） 外源基因在大肠杆菌中的表达形式外源基因在大肠杆菌中的表达形式包涵体包涵体在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构1. 1. 包涵体蛋白包涵体蛋白具有正确的氨基酸顺序，但没有生物活性；水难溶的性质；少受受体细胞蛋白酶影响；易于分离纯化优点：优点：缺点：缺点：融合蛋白融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变2个基因阅读框，以这种方式表达的蛋白叫融合蛋白2. 融合蛋白融合蛋白受体菌蛋白N端，外源蛋白在C端稳定性大大增加水溶性好易于分离纯化构建表达载体时，将多个外源基因串联连接，形成寡聚型外源蛋白有3种方式：多表达单元的重组：每单元有自己的表达调控系统，表达的蛋白不须裂解处理多顺反子重组：共同启动子和终止子，各自的表达单元：SD序列、翻译起始合终止信号多编码序列重组：共同表达调控系统，但各外源基因接口有蛋白酶切位点。

3. 3. 寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白将外源基因整合到宿主细胞染色体上，必须整合到染色体的非必需区同源交换选择不能在受体细胞自主复制的质粒4. 4. 整合型外源蛋白整合型外源蛋白指外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，这样的蛋白叫分泌蛋白优点优点缺点缺点5. 5. 分泌型外源蛋白分泌型外源蛋白（一） 酵母基因表达载体的宿主菌二、酵母基因表达系统二、酵母基因表达系统（二） 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌（三） 抑制超糖基化作用的突变宿主菌赠送精美图标1、字体安装与、字体安装与设置置如果您对PPT模板中的字体风格不满意，可进行批量替换，一次性更改各页面字体1.在“开始”选项卡中，点击“替换”按钮右侧箭头，选择“替换字体”如下图）2.在图“替换”下拉列表中选择要更改字体如下图）3.在“替换为”下拉列表中选择替换字体4.点击“替换”按钮，完成532、替、替换模板中的模板中的图片片模板中的图片展示页面，您可以根据需要替换这些图片，下面介绍两种替换方法方法一：更改图片方法一：更改图片1.选中模版中的图片（有些图片与其他对象进行了组合，选择时一定要选中图片 本身，而不是组合）。

2.单击鼠标右键，选择“更改图片”，选择要替换的图片如下图）注意：注意：为防止替换图片发生变形，请使用与原图长宽比例相同的图片53PPT放映设置PPT放映场合不同，放映的要求也不同，下面将例举几种常用的放映设置方式让让PPT停止自动播放停止自动播放1. 单击”幻灯片放映”选项卡，去除“使用计时”选项即可让让PPT进行循环播放进行循环播放1.单击”幻灯片放映”选项卡中的“设置幻灯片放映”，在弹出对话框中勾选“循 环放映，按ESC键终止”。