抗氧化实验方法
4页1、1还原力的测定样品2ml加到2ml O.2mol/L 酸盐缓冲液(pH6.6)和2ml 1%的铁氟化钾溶液的混台液 中。混台物在5()匕保温20min,然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA,混台后以300()rpm 离心lOmin,取上清液2ml与2ml蒸憎水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应,lOmin 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。注意:建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化,例如2.5, 5之类变化。但具体情况应根据吸 光值大小而定。O.2moi/L PH6.6的诫酸盐缓冲液的配制见附表。铁氟化钾溶液应盛装在棕色瓶中。比色皿的用法:可见光(4()0nm)用玻璃比色皿(即没有标宇母或者标G的比色皿),紫 外光时(4()0nm)用石英比色皿(即标Q宇比色皿)。2 DPPH自由墓清除活性的测定将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/LDPPH的95%乙醇中,混合,振荡,在室温下放W30min,然后在波长517nm处检测(Ai)o清除率计算公式为:X100%空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸憎水调零。式中:Ac对照
2、为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸憎水在517nm处的吸光值;Aj1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值;Ai1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值;注意:逹议酶解液蛋白浓度以2mg/ml左右变化,如05,1,2,2.5之类变化,但是具体情况应 视清除率而定,最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。DPPH样品有毒,雷戴口軍和手套迸行操作。而且HPPH试剂很昂贲,用时注意节约。0.1m mol/L DPPH乙醇溶液的配制:准确称取0.0()395gDPPH,用95%的乙醇溶液溶解并定 容到lOOmlo3在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用 等体积的pH7.45, O.lmoi/LPBS配成,使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液 O.lmL. 25m moll/LFcS()4溶液0.2mL,用PBS缓冲液补足至2.0mLo对照管除不加样液外其 他试剂同前。将上述2种试管同时直37C恒温水浴锅中保温培养lho取出
3、后,加入 20%TCA0.5mL,静萱lOmin后,与对照管于3500r/min商心lOmin,取2.0mL 清液,分别 加入质旻分教为0.8%硫代已比妥酸(TBA)溶液l.OmL,加塞于100C水浴15min,取出冷却。 空白管以2.0mLPBS溶液代替,在532nm下测定吸光度,样品对卵黄脂蛋白LP()的抑制率 表示为:SA(%)=(Ac 一 AS)/AC X 100 式中:Ac不加样品的吸光度As 一加入样品的吸光度注意:卵黄溶液不用时应放宣冰箱保存。酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整,但具体应视清除率大小而定,对醉解液蛋白浓度 进行调整。硫代已比妥酸溶液雷放直于棕色瓶内保存。并以50m mol/L NaOH溶液配制。再在50C 水浴溶解。FuS()4溶液应以棕色瓶盛装。4过氧化值的测定参照本食品学院林华娟等老师主编的食品分析实验讲义一书。5超氧阴离于自由基清除率的测定邻苯三酚自氧化速率(V对照):对照组和空白对照组加入4凶 蒸憎水(去商于水)和, 0.1 mol/LTris-HCl 缓冲溶液(pH8.2) 4.5ml,在 25C 水浴 20min 后,样品组加入 0.2ml
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