Chapter 7B 微生物的生长2【微生物生理学】.pdf

第四节第四节 微生物的培养微生物的培养 研究群体生长规律时，采用的就是分批培养法研究群体生长规律时，采用的就是分批培养法 一、分批培养一、分批培养 batch cultures 分批培养法分批培养法 同步培养法同步培养法 连续培养法连续培养法 同步生长就是群体中的各个细胞在生活周期中处同步生长就是群体中的各个细胞在生活周期中处 于相同的阶段这些细胞，彼此间形态结构、生于相同的阶段这些细胞，彼此间形态结构、生 理生化特性等都很一致所以是研究细胞学、生理生化特性等都很一致所以是研究细胞学、生 理学和生物化学的极好材料理学和生物化学的极好材料 二、同步培养二、同步培养 synchronous cultures 处于对数生长期的酵母细胞处于对数生长期的酵母细胞 （一）同步培养的概念（一）同步培养的概念 筛选法又称淘析法，其原理是根据处于同一生长筛选法又称淘析法，其原理是根据处于同一生长 阶段的细胞，其体积、大小是相等的，故可以用阶段的细胞，其体积、大小是相等的，故可以用 过滤法、密度梯度离心法、膜洗脱法等收集到同过滤法、密度梯度离心法、膜洗脱法等收集到同 步细胞 1.筛选法筛选法 目前常用的获得同步生长细胞的方法有两种：目前常用的获得同步生长细胞的方法有两种： 即筛选法和诱导法即筛选法和诱导法。

应避免人为引起微生物形应避免人为引起微生物形 态态、、结构结构、、生理生化特性的改变生理生化特性的改变 （二）获得同步生长细胞的方法（二）获得同步生长细胞的方法 筛选法获取同步生长细胞筛选法获取同步生长细胞 2. 诱导法诱导法 利用一些生理学手段干预微生物使其达到同步生长的目利用一些生理学手段干预微生物使其达到同步生长的目 的，有化学诱导法和物理诱导法两种的，有化学诱导法和物理诱导法两种 限制或停止供给微生物细胞分裂所必须的某种养分限制或停止供给微生物细胞分裂所必须的某种养分，， 使所有的细胞都进入临分裂状态使所有的细胞都进入临分裂状态，，然后在某一时刻恢复然后在某一时刻恢复 供给这种养分供给这种养分，，所有的细胞开始同步分裂所有的细胞开始同步分裂，，从而获得同从而获得同 步生长的细胞步生长的细胞 （（1）化学诱导）化学诱导 利用某种物理因子，使处于即将分裂的细胞的代谢利用某种物理因子，使处于即将分裂的细胞的代谢 活动受到抑制，从而使细胞在分裂阶段前停步使群体活动受到抑制，从而使细胞在分裂阶段前停步使群体 中那些分裂准备工作进行较慢的细胞有时间赶上其它细中那些分裂准备工作进行较慢的细胞有时间赶上其它细 胞，一旦恢复正常条件就能获得同步生长。

胞，一旦恢复正常条件就能获得同步生长 （（2）物理诱导）物理诱导 如果分裂阶段中某些关键反应对温度（高于或低于最如果分裂阶段中某些关键反应对温度（高于或低于最 适温度）的敏感性比合成期高，那么高温或低温就可适温度）的敏感性比合成期高，那么高温或低温就可 以阻止细胞分裂，但不妨碍细胞物质的合成（即分裂以阻止细胞分裂，但不妨碍细胞物质的合成（即分裂 的准备）这样可以使群体中那些分裂准备工作进行的准备）这样可以使群体中那些分裂准备工作进行 较慢的细胞有时间赶上其它细胞，一旦恢复正常条件较慢的细胞有时间赶上其它细胞，一旦恢复正常条件 就能获得同步生长就能获得同步生长 例如例如Escherichia coli在在25下培养一段时间后，再置于下培养一段时间后，再置于37下下 继续培养，便可诱导群体中许多细胞进行分裂反复多次将细继续培养，便可诱导群体中许多细胞进行分裂反复多次将细 胞置于亚适温度（世代时间的大部分）和最适温度（世代时间胞置于亚适温度（世代时间的大部分）和最适温度（世代时间 的小部分）培养，就可获得同步培养细胞的小部分）培养，就可获得同步培养细胞 温度为诱导因子温度为诱导因子 原理：原理： 细胞周期不同，对温度的敏感性也不同。

细胞周期不同，对温度的敏感性也不同 有时将化学与物理诱导结合使用有时将化学与物理诱导结合使用，，常可得到更好的常可得到更好的 同步效果同步效果 例如例如Escherichia coli在在25下培养一段时间后，再置下培养一段时间后，再置 于于37下继续培养，便可诱导群体中许多细胞进行分下继续培养，便可诱导群体中许多细胞进行分 裂反复多次将细胞置于亚适温度（世代时间的大部裂反复多次将细胞置于亚适温度（世代时间的大部 分）和最适温度（世代时间的小部分）培养，就可获分）和最适温度（世代时间的小部分）培养，就可获 得同步培养细胞得同步培养细胞 同样同样，，将细胞交替在亚适将细胞交替在亚适pH和最适和最适pH下培养下培养，，如如 Escherichia coli从从pH 5.5 到到 pH 7.0，，也可获得同步培也可获得同步培 养养 对光合微生物可使用照光和黑暗交替培养也能诱导对光合微生物可使用照光和黑暗交替培养也能诱导 同步生长同步生长 同步生长曲线同步生长曲线 时间时间 (h) 活 细 胞 数 量 活 细 胞 数 量 理论曲线理论曲线 实际曲线实际曲线 在分批培养的对数生长期中在分批培养的对数生长期中，，由于营养物由于营养物 质的逐渐耗尽和产生有毒的代谢物质等原因质的逐渐耗尽和产生有毒的代谢物质等原因，， 而最终导致生长速度的降低而最终导致生长速度的降低，，生长进入稳定阶生长进入稳定阶 段段。

如果在此期间不断供应营养物质如果在此期间不断供应营养物质，，同时移同时移 去代谢产物去代谢产物，，那么就可以无限期地延长对数生那么就可以无限期地延长对数生 长期长期 三、连续培养三、连续培养 （一）连续培养的原理（一）连续培养的原理 连续培养的装置连续培养的装置 恒化器恒化器: :是以一定的培养液是以一定的培养液 流速从外面加以控制的，流速从外面加以控制的， 这种流速小于微生物的最这种流速小于微生物的最 大生长速度大生长速度 恒化器恒化器 泵泵 光光 光电池光电池 控制器控制器 恒浊器恒浊器 恒浊器恒浊器: :靠光电池以检测微靠光电池以检测微 生物的生长量从内部加以生物的生长量从内部加以 控制的来自光电池的信控制的来自光电池的信 号控制新鲜培养基加入的号控制新鲜培养基加入的 速度，使培养的微生物能速度，使培养的微生物能 以最大的速度生长当培以最大的速度生长当培 养液中微生物的密度降低养液中微生物的密度降低 时，就停止新鲜培养基的时，就停止新鲜培养基的 加入，培养液也就停止外加入，培养液也就停止外 流当培养物达到最大生流当培养物达到最大生 长量时，新鲜培养基又自长量时，新鲜培养基又自 动流入，同时流出等量的动流入，同时流出等量的 培养物。

培养物 装置装置控制对象控制对象培养基培养基培养基培养基 流速流速 生长速率生长速率产物产物应用范围应用范围 恒化器恒化器培养基流速培养基流速 （外控制）（外控制） 有限制生有限制生 长因子长因子 恒定恒定低于最高低于最高 速率速率 不同生长速不同生长速 率的菌体率的菌体 实验室为实验室为 主主 恒浊器恒浊器菌体密度菌体密度 （内控制）（内控制） 无限制生无限制生 长因子长因子 不恒定不恒定最高速率最高速率大量菌体或大量菌体或 与菌体相平与菌体相平 行的代谢产行的代谢产 物物 生产为主生产为主 恒化器与恒浊器的比较恒化器与恒浊器的比较 为了表示培养液更换速度的快慢，引入稀释度为了表示培养液更换速度的快慢，引入稀释度(D)(D)的概念，的概念， 定义为单位时间内，流入的新鲜培养基的体积定义为单位时间内，流入的新鲜培养基的体积(f)(f)与培养器与培养器 内培养液总体积内培养液总体积(V)(V)之比 D= f / VD= f / V 1.稀释度稀释度 在恒化器中控制微生物生长的最重要的因子是新鲜培养基加在恒化器中控制微生物生长的最重要的因子是新鲜培养基加 入的速度若加得太快，微生物来不及利用就又流出，培养入的速度。

若加得太快，微生物来不及利用就又流出，培养 物被稀释如果加得太慢，营养不足及有毒代谢产物的累积，物被稀释如果加得太慢，营养不足及有毒代谢产物的累积， 使微生物的生长速率下降，而进入稳定生长期因此，控制使微生物的生长速率下降，而进入稳定生长期因此，控制 新鲜培养基的加入速度，便成为连续培养的关键新鲜培养基的加入速度，便成为连续培养的关键 稀释度的倒数表示培养液在培养器中的平均停留时间稀释度的倒数表示培养液在培养器中的平均停留时间 = 1 / D = V / f 连续培养成立的一个先决条件是：在尚未形成连续培养时连续培养成立的一个先决条件是：在尚未形成连续培养时，， 培养器中微生物必须处于对数生长期培养器中微生物必须处于对数生长期 在对数生长期在对数生长期，，细胞浓度的增量为：细胞浓度的增量为： dN/dt=uNdN/dt=uN 2. 稀释度与生长速率的关系：稀释度与生长速率的关系： 当流入新鲜培养基时当流入新鲜培养基时，，同时又流出等量的培养物同时又流出等量的培养物，，那么培养那么培养 器内的细菌数目必然随之减少器内的细菌数目必然随之减少，，减少的速度为：减少的速度为： - - dN/dt=DNdN/dt=DN 因此培养器内单位时间内细胞浓度的增加等于细菌的繁殖所因此培养器内单位时间内细胞浓度的增加等于细菌的繁殖所 引起的浓度增加和因流出而减少的差值引起的浓度增加和因流出而减少的差值，，即：即： dN/dt=uNdN/dt=uN- -DN=N(uDN=N(u- -D)D) 2. 如果如果u

3. 如果如果u=D，，即细胞增长速率等于细胞流出速率即细胞增长速率等于细胞流出速率，， dN/dt=0，，说明培养器内微生物的浓度保持恒定说明培养器内微生物的浓度保持恒定 3. 3. 稀释度、菌体浓度、底物浓度三者之间的关系稀释度、菌体浓度、底物浓度三者之间的关系 S=Ks D um-D =DS0 - uN - DS1 dS dt Y N=Y(S0 -)Ks D um-D 稳定状态下稳定状态下u=D时，产生的细胞量时，产生的细胞量 依赖于流入的底物浓度（依赖于流入的底物浓度（S）和稀）和稀 释度（释度（D）） 培养器中底物的变化为：培养器中底物的变化为： 底物流入量底物流入量底物流出量底物流出量微生物微生物 的消耗量的消耗量 稳定状态下生长限制性底物浓度、稳定状态下生长限制性底物浓度、 细菌浓度与其他参数之间的关系细菌浓度与其他参数之间的关系 连续发酵的优点：连续发酵的优点： 自控性自控性 ，便于利用各种仪表进行自动控制，便于利用各种仪表进行自动控制 高效，它使装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等工艺简化了，高效，它使装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等工艺简化了， 缩短了生产时间和提高了设备的利用效率缩短了生产时间和提高了设备的利用效率 产品质量较稳定产品质量较稳定 节约了大量动力、人力、水和蒸汽节约了大量动力、人力、水和蒸汽 不足之处：不足之处： 主要是菌种易于退化，使微生物长期处于高速繁殖的条件主要是菌种易于退化，使微生物长期处于高速繁殖的条件 下，即使自发突变率很低，也难以避免变异的发生，下，即使自发突变率很低，也难以避免变异的发生， 容易污染，在连续发酵中，要保持各种设备无渗漏，通气容易污染，在连续发酵中，要保持各种设备无渗漏，通气 系统不出任何故障，是极其困难的。

因此，“连续”是有时系统不出任何故障，是极其困难的因此，“连续”是有时 间限制的，一般可达数月间限制的，一般可达数月 连续培养中，营养物的利用率低于分批培养连续培养中，营养物的利用率低于分批培养 在发酵工业中，连续培养技术已广。