【生物课件】重组DNA技术的基本工具课件 2022-2023学年高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

TGCCGTAA5353磷酸二酯键磷酸脱氧核糖氢键反向平行复习GGATCATCATAT磷酸二酯键氢键氢键 ATGCCGTGGAATTCC ATGCCGTGGAATTCC TACGGCACCTTAAGG TACGGCACCTTAAGG 磷酸二酯键磷酸二酯键氢键氢键普通棉花转基因抗虫棉苏云金芽孢杆菌抗虫基因棉花细胞基因工程提取概念基因工程 基因工程基因工程是指按照人们的愿望，通过是指按照人们的愿望，通过转基因转基因等技术，等技术，赋予生物新赋予生物新的遗传特性的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品生物类型和生物产品从技术操作层面看，由于基因工程是在技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平分子水平上进行设计和施工上进行设计和施工的，因此又叫作的，因此又叫作重组重组DNA技术技术归纳定义】工程别名：操作对象：操作水平：工程实质：意义：DNA重组技术基因DNA分子水平基因重组“分子手术刀分子手术刀分子手术刀分子手术刀”“分子缝合针分子缝合针分子缝合针分子缝合针”“分子运输车分子运输车分子运输车分子运输车”定向改造生物性状 第第3章章 第第1节节重组DNA技术的基本工具 01限制性内切核酸酶“分子手术刀”1、来源：主要从原核生物中分离纯化出来3、特点：能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

2、种类：数千种（限制酶不是一种酶，而是一类酶）酶的酶的专一性专一性4.4.大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成（少数限制酶识别序列为4个、8个等）黏性末端黏性末端5353中心轴线中心轴线EcoR 01限制性内切核酸酶“分子手术刀”EcoR限制酶大肠杆菌(E.coli)的EcoR限制酶能特异性识别 序列，并切割 和 之间的 切割后产生_GAATTCGA磷酸二酯键黏性末端中轴线两侧中轴线两侧平末端平末端5353Sma 01限制性内切核酸酶“分子手术刀”5.结果：产生的DNA片段通常有两种形式：和 黏性末端平末端SmaI 限制酶只能识别 序列，切割 和 之间的 切开，切割后产生 CCCGGGCG磷酸二酯键平末端SmaI 限制酶中轴线中轴线 01限制性内切核酸酶“分子手术刀”根据你所掌握的知识,推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么？主要起到切割外源DNA，使之失效，从而保护自身的安全旁栏旁栏旁栏旁栏思考思考思考思考为什么限制酶不切割原核生物本身的DNA?原核生物DNA分子中不存在限制酶的识别序列或识别序列已经被修饰Spe_ Hind _ Xba _ Xho_ Spe_ Hind _ Xba _ Xho_ 思考：思考：你从中发现了什么现象？你从中发现了什么现象？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端现学现用：现学现用：现学现用：现学现用：写出下列限制酶切割形成的黏性末端写出下列限制酶切割形成的黏性末端写出下列限制酶切割形成的黏性末端写出下列限制酶切割形成的黏性末端相同的黏性末端也可能是由不同限制酶切割相同的黏性末端也可能是由不同限制酶切割CTAG-CTAG-CTAG-CTAG-AGCT-AGCT-AGCT-AGCT-CTAG-CTAG-CTAG-CTAG-TCGA-TCGA-TCGA-TCGA-请你找到两条片段上EcoR I的识别序列和切割位点。

然后，用剪刀进行“切割”待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来活动种种类类Ecoli DNA连接接酶T4 DNA连连接接酶酶来源来源作用作用相同点相同点大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体只能将只能将具有具有互补黏性末端互补黏性末端的的DNA片段片段连接起来连接起来既可以既可以“缝合缝合”双链双链DNA片段片段互补的黏性末端互补的黏性末端，又，又可以可以“缝合缝合”双链双链DNA片片段的段的平末端平末端（但连接平末（但连接平末（但连接平末（但连接平末端的效率相对较低）端的效率相对较低）端的效率相对较低）端的效率相对较低）恢复恢复的都是的都是磷酸二酯键磷酸二酯键 02DNA连接酶“分子缝合针”1.作用：2.种类：将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来注意:DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA；也不能连接RNA！种种类类Ecoli DNA连接接酶T4 DNA连连接接酶酶来源来源作用作用相同点相同点大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体只能将只能将具有具有互补黏性末端互补黏性末端的的DNA片段片段连接起来连接起来既可以既可以“缝合缝合”双链双链DNA片段片段互补的黏性末端互补的黏性末端，又，又可以可以“缝合缝合”双链双链DNA片片段的段的平末端平末端（但连接平末（但连接平末（但连接平末（但连接平末端的效率相对较低）端的效率相对较低）端的效率相对较低）端的效率相对较低）恢复恢复的都是的都是磷酸二酯键磷酸二酯键 02DNA连接酶“分子缝合针”1.作用：2.种类：将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

A A T A A T T T GGC CA AA AT TT TA AA AT TT TDNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶思考：思考：思考：思考：DNADNADNADNA连接酶和连接酶和连接酶和连接酶和DNADNADNADNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质不同点模板作用对象都能催化形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键不需要不需要需要需要DNA的一条链作模板的一条链作模板将将单个脱氧核苷酸单个脱氧核苷酸连接到连接到已有的已有的DNA片段上片段上连接连接两个两个DNA片段片段归纳总结归纳总结几种相关酶的比较几种相关酶的比较名称作用部位作用结果限制酶 DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键碱基对中的氢键将DNA切成两个片段磷酸二酯键连接两个DNA片段磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链2.下列有关DNA连接酶的叙述正确的是()A.T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来B.E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接C.DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键D.DNA连接酶可连接DNA双链的氢键,使双链延伸C练习册练习册P69P69页页 03基因进入受体细胞的载体“分子运输车”质粒将外源基因送入受体细胞,在受体细胞内对目的基因进行大量复制。

1.作用：动植物病毒噬菌体2.种类：质粒质粒是一种裸露的、结构简单、是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核胞拟核DNADNA之外，并具有自我复制之外，并具有自我复制能力的能力的环状双链DNA分子拟核拟核质粒质粒大肠杆菌大肠杆菌氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因目的基因目的基因复制起点复制起点标记基因：用便于重组DNA分子的筛选真正被用作载体的质粒，都是在天真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过然质粒的基础上进行过人工改造人工改造的最常用最常用有一个至多个限有一个至多个限制酶切割制酶切割位点DNADNA分子复制的起分子复制的起点，点，保证插入目的保证插入目的基因大量复制基因大量复制特殊的标记基因：特殊的标记基因：作用：鉴别作用：鉴别和和筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞抗生素的抗生素的抗性基因抗性基因、绿色荧光基因绿色荧光基因3 3.载体需具备的条件载体需具备的条件:有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入拟核拟核质粒质粒大肠杆菌大肠杆菌氨苄青霉素氨苄青霉素抗性基因抗性基因目的基因目的基因复制起点复制起点 03基因进入受体细胞的载体“分子运输车”能在细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选 对受体细胞无害学会归纳细胞膜上的载体与基因工程中的载体比较细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞,与细胞膜的选择透过性有关；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。

细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)；也可能是生物，如动植物病毒、噬菌体等欲将抗虫基因插入质粒中，该选择什么限制酶？载体载体目的基因目的基因自连自连片段间片段间的连接的连接目的基因自连目的基因自连质粒自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与质粒连接目的基因与目的基因与目的基因目的基因连接连接质粒质粒与质粒连接与质粒连接正向连接正向连接 反向连接反向连接1 1112 2221 12 222112 222111 1限制酶的选择方法：使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒（但要保证质粒上也有这两种酶的切点）避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接欲将抗虫基因插入质粒中，该选择什么限制酶？BamH和HindA应用 1.限制酶Mun;和限制酶EcoR ;的识别序列及切割位点分别是-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAG-和-GAATTC-GAATTC-GAATTC-GAATTC-下图表示四种质粒和目的基因,其中,质粒上箭头所指部位为酶的识别位点,阴影部分表示标记基因适于作为图示目的基因载体的质粒是()练习册练习册P69P69页页应用 1.如图是三种限制酶的脱氧核苷酸识别序列和切割位点示意图(表示切点)。

下列相关分析错误的是()DA.这三种限制酶切割出的DNA片段末端都是黏性末端B.不同限制酶切割DNA所得的黏性末端可能相同C.能被限制酶3切割的DNA也能被限制酶1切割D.同一个DNA经限制酶1和限制酶3分别切割后所得片段数一定相等练习册练习册P68P68页页DNA的粗提取与鉴定一、实验原理：1提取原理2鉴定原理DNA不不溶溶于于酒酒精精，但但某某些些蛋蛋白白质质溶溶于于酒酒精精可可以以初初步步分分离离DNA与蛋白质与蛋白质）在一定温度下，在一定温度下，DNA遇遇二苯胺试剂二苯胺试剂会呈现会呈现蓝色蓝色DNA在在不不同同浓浓度度的的NaCl溶溶液液中中溶溶解解度度不不同同，能能溶溶于于2mol/L的的NaCl溶液溶解提纯溶液溶解提纯DNA）00.14NaCI浓度（浓度（mol/L）DNA溶溶解解度度DNA含量相对较高含量相对较高的生物组织，如的生物组织，如新鲜洋葱新鲜洋葱、香蕉、菠菜、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等菜花和猪肝等不能不能,因为哺乳动物成熟的红细胞中因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体无细胞核和线粒体二、材料用具1.选材：2.试剂：研磨液体积分数为95%的酒精2mol/L 的NaCl溶液二苯胺试剂蒸馏水破坏细胞，释放出细胞内的物质，维持破坏细胞，释放出细胞内的物质，维持DNADNA稳稳定，提高定，提高DNADNA溶解度溶解度析出析出DNA溶解溶解DNA鉴定鉴定DNA，要现配现用，要现配现用DNA的粗提取与鉴定是否能用哺乳动物成熟的红细胞是否能用哺乳动物成熟的红细胞？注意：+充分研磨方法一：纱布过滤研磨液，4冰箱中静置取 ；方法二：研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。

2.取上清液1.破碎细胞 洋葱研磨液上清液上清液三.方法步骤加入 溶液,静置23min，溶液中出现的 （粗提取的DNA）3.DNA的析出预冷的酒精白色丝状物析出DNA白色丝状物+2mol/L的NaCl+颜色变化4.DNA的鉴定二苯胺沸水中加热5min，冷却思考：这个实验如何设置对照组？1.1.抑制核酸水解酶的活性，防止抑制核酸水解酶的活性，防止DNADNA的降解的降解2.2.降低分子运动，易于形成沉淀析出降低分子运动，易于形成。