DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳实验原理及步骤.doc

实验6 DNA的酶切和琼脂糖凝胶电泳目的要求（1）掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法2）学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小3）学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电脉时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭（菲啶溴红）染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.5—1μg，超薄型平板琼脂糖凝胶电泳所需DNA可低于0.5μg溴乙锭检测DNA，灵敏度很高，10ng（10-9g）或更少的DNA即可检出DNA在凝胶中的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小质粒DNA分子量一般在106—107范围内，如质粒pBR322的分子量为2.8×106质粒DNA在细胞内存在可以有3种形式；共价闭环(ccc DNA)、线形DNA和开环的双链环状（opDNA）电泳时，同一质粒超螺旋DNA的泳动速度比开环和线形DNA的泳动速度为快。

提取制备的质粒DNA中，常存在超螺旋和开环DNA，在凝胶板上即可显示出2条迁移位置不同的荧光条带（见图34.1）本实验采用限制性内切酶Hind Ⅲ或EcoR Ⅰ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘帛出测定DNA分子量的标准曲线共价闭环质粒pBR322 DNA只有一个EcoR Ⅰ酶切位点，酶解后成为一条完整线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小同时通过与标准pBR322 EcoR Ⅰ酶切图谱的比较分析，可以对提取质粒DNA进行鉴定除单酶解外，还可以进行双酶解和多酶解，通过对这些内切酶的琼脂糖凝胶电泳图谱的分析，对DNA主要酶解片段大小的数据进行逻辑推理，便可得出该DNA分子内各主要片段的排列顺序，因此，DNA限帛性内切酶酶解图谱的构建，对于DNA序列分析，基因组的功能图谱、DNA的无性繁殖、基因文库建立等都是必不可少的环节限制性内切酶酶解图谱也已应用于某些遗传疾病的诊断试剂和器材一、 试剂限制性内切酶 HindⅢ和EcoRⅠ，标准pBR322，标准λDNA（外购）。

1.Hind Ⅲ酶解缓冲液与商品酶一齐由厂家提供或按以下配方配制（10×缓冲液）：100mmol/L Tris，pH7.4，100m mol/L MgCl2，1mg/mol BSA（牛血清 清蛋白）10m mol/L DTT(二硫苏糖醇)和0.5mol/L NaCl称取1.21g Tris，0.95g MgCl2，100mg BSA，0.15g DTT，2.92g NaCl，双蒸水溶解后，定容至100mlEcoR Ⅰ 酶解缓冲液中的NaCl浓度改为1mol/L，其余同Hind Ⅲ缓冲液其他限帛性内切酶相应缓冲液参阅附录九（四）2.酶反应终止液（10×0.1mol/L EDTA，20% Ficoll，0.25%溴酚蓝或橙G）称取3.72g EDTA·Na2·2H2O，20g Ficoll，0.25g溴酚蓝，溶解后定容至100ml3.电极缓冲液（5×TBE）0.45mol/L Tris，0.45mol/L 硼酸，0.01mol/L EDTA,pH8.3称取10.88g Tris，5.52g硼酸，0.74g EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml使用时，用蒸馏水水稀释10倍称为TBE稀释缓冲液（0.5×TBE）4.溴乙绽（EB）染我贮存液（1mg/ml）将100mg溴乙绽溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。

二、 器材Eppendorf离心管（1.5ml，经消毒），电泳槽，电泳仪，凝胶塑料托盘（外购商品或自制，见图34.2）电泳样品槽模板（梳子），锥形瓶（100ml），小烧杯（50，100，250ml），橡皮膏，电热恒温箱，玻璃纸操作方法一、DNA的酶解一般DNA的用量在0.5— 1.0μg内即可获得条带清蜥的电泳图谱实验33碱裂解法制备的质粒DNA 20μl可以做2条电泳分析取10μl进行酶解，其余10μl做不酶解对照标准λDNA和pBR322需根据购进商品的浓度加入0.5—1.0μg为了酶解反应进行完全，需要加入过量的酶液，酶量往往是DNA量的2—3倍或更多，并需同时加入各种限制性内切酶相应的缓冲液，最后用双蒸水补足至20μl取7只清洁、干燥、无菌的Eppendorf离心管，编号，按照表34.1，用移液枪加入各种试剂此步操作必须非常仔细，认真，反复核对，保证准确无误加样后，小心混匀，37℃保温1—2h，然后各小管内加入2μl（1/10V）的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用表34.1 DNA酶解加样表管号1234567自提质粒DNAλDNA（0.55μg/μl）pBR322(0.44μg/μl)1010110.51010限制性内切酶（10U/μl）EcoRⅠ Hind Ⅲ 0.80.80.50.8酶解缓冲液EcoR ⅠHind Ⅲ2.02.02.02.0双蒸水补足至20μl表内单位为μl二、1.0%琼脂糖凝胶板的制备（1）称取0.5g琼脂糖置于小锥形瓶中，加入50ml TBE稀释缓冲液，沸水浴中（或高压消毒锅、微波炉）加热，直至琼脂糖完全熔化在缓冲液中，取出轻轻摇匀，避免产生泡沫。

2）用橡皮膏将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或工作台面上（须调水平），将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（跑一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5—1mm的间隙3）待琼脂糖冷至65℃左右，取25ml小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×9.0cm）胶内不要存有气泡，室温下静置0.5—1h4）待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TBE稀释液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽5）取下封边的橡皮膏，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，用TBE稀释液先填满加样槽，防止槽内窝存气泡，接着再倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2—3mm三、加样用微量注射器将1—7号酶解后的样品液分别加入到胶板的加样槽内，每个槽（5×2×2.5mm）容积约为25μl，因此加样量不宜超过20μl，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品加样时，注射器针头穿过缓冲液小心插入加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。

四、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm（电压值V/电泳槽两极之间距离cm）当染料条带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳五、染色将电泳后的胶板小心推至0.5μg/ml溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min六、观察和拍照小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴乙锭溶液，然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254nm紫外灯下进行观察DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，荧光在4—6h后减弱，因此初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害拍照时，照相机加上近摄接圈和红色滤光镜头，用全色胶卷，5.6光圈，曝光时间根据条带荧光的强弱进行选择，10—60s将电泳图谱底片适当放大为照片七、制作测定分子量标准曲线在放大的电泳照片上用卡尺测量出λDNA Hind Ⅲ酶解各片段的迁移距离（cm），以DNA酶解各片段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点划出曲线，即为DNA分子量的标准曲线。

λDNA-Hind Ⅲ酶解和λDNA-EocR Ⅰ酶解各片段大小见表34.2，表34.3表34.2 λDNA-Hind Ⅲ酶解片段片段碱基对数目（kb）道尔顿（×106）123.13015.029.4196.1236.5574.2644.3712.8452.3221.5162.0281.3270.5640.3780.1250.08表34.3 λDNA-EcoR Ⅰ酶解片段片段碱基对数目（kb）道尔顿（×106）121.22613.727.4214.7435.8043.7345.6433.4854.8783.0263.5302.13八、质粒DNA大小的测定将自提质粒DNA EcoRⅠ酶解和非酶解电泳图谱与标准pBR322 DNA EcoR Ⅰ酶解和非酶解电泳图谱进行比较同时测量出酶解后，自提和标准质粒线状DNA条带迁移距离，在上述标准曲线上，查出相应的分子大小，两者加以比较根据以上这些实验结果，试对自提质粒DNA纯度进行分析1）制胶时，若没有现成的凝胶托盘，也可直接在合适大小的玻璃板上制胶用橡皮膏将玻板四周围起来，形成一个框，将玻板置于水平板上，取两个文具夹分别夹住样品槽模板两端，并以夹子为支架将之垂直立于玻板距一端2cm处（图34.3），上下调节样品槽模板的位置，使样品槽模析各齿的下端应该与玻板表面保持0.5—1mm的间隙，也可在样品槽模板下压2层普通滤纸以保持一定的间隙，一般能允许2层滤纸通过的间隙即较合适。

2）EB染色液亦可在灌胶前加入凝胶内，终浓度达到0.5μg/ml电泳后电极缓冲液即含有EB注意事项（1）溴乙锭（EB）是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗和弃去2）为了使DNA完全酶解，需要加入适量、足够的酶液太少反应不完全，太多则浪费由于每次购进的酶浓度不可能相同，购进的λDNA和pBR322浓度也不一样，因此，酶和DNA加入的体积不能固定，加样表中的量只能作为一个参考，合适的酶量应该通过预试验来确定3）DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒配制试剂需用灭菌的双蒸水，还要防止限制性内切酶被污染4）加样量的多少决定于加样槽最大容积可以采用大小不同的样品槽模板以形成容积不同的加样槽，加入样品的体积应略少于加样槽容积，为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩5）λDNA经Hind Ⅲ酶切后应有8条带，但实际上只能看见6条带，分子量小的二条带由于其荧光很弱，往往看不见思考题1.总结本实验操作的关键环节2.说明DNA限制性内切酶图谱的构建在核酸研究和遗传工程等方面的应用价值。