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菌种的保存,真空冷冻干燥法

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卖家[上传人]：小**

文档编号：93202790

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1、菌种的保存：真空冷冻干燥法1准备安培管用于真空冷冻菌种保藏的安培管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安培管。大小要求外径67.5mm，长105 mm，球部直径911 mm，壁厚0.61.2 mm，也可用没有球部的管状安培管。先用2%盐酸浸泡810h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗23次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好脱脂棉塞，121下高压灭菌20分钟，备用。2准备菌种用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几十年，为了不出现差错，所用菌种纯度要高，而且菌龄要适宜。细菌和酵母菌的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活期反而降低。一般细菌的菌龄要求2448h；酵母菌为3d；形成孢子的微生物则宜保藏孢子；放线菌和丝状真菌菌龄为710d。3保护剂的选择和准备选取新鲜牛奶作为保护剂，牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂， 115下高压蒸汽灭菌25min，备用。4菌种准备及分装菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加23ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)

2、，制成菌悬液。如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到1081010个/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，每管分装量约0.10.2毫升，分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 5 预冻 -80冰箱预冻12小时。 6冷冻干燥将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断：安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；真空度接近空载时的最高值；选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结。 7封口抽真空干燥后，取出安培瓶，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10min即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安培管颈中央进行封口。8保藏安瓿管保藏在-20冰箱里。9活化如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，用镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端，使管子破裂，在安瓿管中加入0.51ml液体培养基，慢慢旋转安瓿管，使冻干菌种复水，然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。

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