菌种的保存,真空冷冻干燥法
2页1、菌种的保存:真空冷冻干燥法1准备安培管 用于真空冷冻菌种保藏的安培管宜采用中性玻璃制造,形状可用长颈球形底的,亦称泪滴型安培管。大小要求外径67.5mm,长105 mm,球部直径911 mm,壁厚0.61.2 mm,也可用没有球部的管状安培管。先用2%盐酸浸泡810h,再经自来水冲洗多次,用蒸馏水涮洗23次,烘干;在每管内放入打好菌号及日期的标签,字面朝向管壁,管口塞好脱脂棉塞,121下高压灭菌20分钟,备用。2准备菌种 用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几十年,为了不出现差错,所用菌种纯度要高,而且菌龄要适宜。细菌和酵母菌的菌龄要求超过对数生长期,若用对数生长期的菌种进行保藏,其存活期反而降低。一般细菌的菌龄要求2448h;酵母菌为3d;形成孢子的微生物则宜保藏孢子;放线菌和丝状真菌菌龄为710d。3保护剂的选择和准备 选取新鲜牛奶作为保护剂,牛奶要先脱脂,用离心方法去除上层油脂, 115下高压蒸汽灭菌25min,备用。4菌种准备及分装 菌种要求为生长良好的纯种,菌龄以处于稳定期为好,孢子是新鲜的。每支长好的斜面加23ml保护剂,用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)
2、,制成菌悬液。如用液体培养的菌种,则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞,收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到1081010个/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部,每管分装量约0.10.2毫升,分装安瓿管时间尽量要短,最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。 5 预冻 -80冰箱预冻12小时。 6冷冻干燥 将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内,开始冷冻干燥,时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断:安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状;真空度接近空载时的最高值;选用1-2支对照管,其水份与菌悬液同量,视为干燥完结。 7封口 抽真空干燥后,取出安培瓶,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管继续抽气,约10min即可达到26.7Pa(0.2mmHg)。于真空状态下,以煤气喷灯的细火焰在安培管颈中央进行封口。8保藏 安瓿管保藏在-20冰箱里。9活化 如果要从中取出菌种恢复培养,可先用75%酒精将管的外壁消毒,用镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端,使管子破裂,在安瓿管中加入0.51ml液体培养基,慢慢旋转安瓿管,使冻干菌种复水,然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。
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