基因定点突变
3页1、基因定点突变一,定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基.二,定点突变的原理通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了.三,引物设计原则引物设计的一般原则不再重复.突变引物设计的特殊原则:(1)通常引物长度为2545 bp,我们建议引物长度为3035 bp.一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12 bp.若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物. (2)如果设定的引物长度为30 bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78(GC含量应大于40%). (3)如果Tm值低于78,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78(GC含量应大于40%). (4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置. (5)最好使用经过纯化的引物.Tm值计算公式:Tm=0.41(% of G
2、C)675/L+81.5 注:L:引物碱基数;% of GC:引物GC含量.四,引物设计实例以GCGACG为例:5-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3(1)首先设计30 bp长的上下游引物,并将A (T)设计在引物的中央位置.Primer #1: 5-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3 Primer #2: 5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3(2)引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.4140-675/30+81.5).通过计算可以看出其Tm低于78,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度.(3)重新调整引物长度.Primer #1: 5-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3 Primer #2: 5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式
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