WB实验操作流程
17页1、Western Blot 实验操作指南 Western Blot 即蛋白质印迹法(免疫印迹试验) ,是分子生物学、生物化学和免疫遗 传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生 物组织样品中的特定蛋白进行显影。通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所 分析的细胞或组织中表达情况的信息。 实验流程 主要包括以下几个步骤: 样品制备;SDS-PAGE 凝胶电泳;转膜;封闭;免疫杂交;显影。 实验器材 操作步骤 样品制备 准备进行 western blot 的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。样品 为蛋白溶液时不需要进行提取,而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性 对其进行提取。根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。 (1)以体外培养的贴壁细胞样本为例,对其进行总蛋白提取: 1、 倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使 残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走) 。 2、 每瓶细胞加 3ml 4预冷的 PBS(0.01M pH7.27.3) 。平放轻轻摇动 1min 洗涤细 胞,然后
2、弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培 养瓶置于冰上。 3、 按 1ml 裂解液加 10 l PMSF(100mM) ,摇匀置于冰上。 (PMSF 要摇匀至无结晶 时才可与裂解液混合。 ) 4、 每瓶细胞加 400 l 含 PMSF 的裂解液,于冰上裂解 30min,为使细胞充分裂解培养 瓶要经常来回摇动。 5、 裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快) ,然后用枪将细胞碎 片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。 (整个操作尽量在冰上进行。 ) 6、 于 4下 12000rpm 离心 5min。 (提前开离心机预冷) 7、 将离心后的上清分装转移倒 0.5min 的离心管中放于20保存。 (2)以哺乳动物组织样本为例,对其进行总蛋白提取: 1. 将 100 mg 组织剪切成小块,加入适量的冰冷 PBS 洗涤两次后,4,700g(3000 rpm) 离心 3 min,弃上清。20mg 组织加入 100l 裂解液,置玻璃匀浆器冰上均质 30 50 次。(如使用组织匀浆机,则按照 20 mg 组织加入 100 l 裂解液的比例加入裂解液。
3、 每个试管加入 2 个直径 2 mm 的磁珠。将试管放入组织匀浆机中,60 HZ,300s。充分裂 解后,10000 g 离心 5 min,取上清。) 2. 最大速度涡旋震荡 10sec,冰上放置 20 min,期间取出震荡 3-5 次,再于 4, 12000 rpm 离心 10 min,以沉淀组织或细胞碎片,取上清。 生工相关产品: 产品编号 产品名称 产品编号 产品名称 C510001 细胞核蛋白/浆蛋 白抽提试剂盒 C500005、 C510006、 C500007、 C500008 RIPA 裂解液 IIV C510002 膜蛋白、核蛋白和 胞质蛋白抽提试剂 盒 C510003 动物全蛋白提取试 剂盒 C510005 膜蛋白和胞质蛋白 提取试剂盒 C500058 石蜡包埋组织蛋白 提取试剂盒 C500009 细胞核蛋白质提取 试剂盒 C500049 膜蛋白提取试剂盒 C500051 胞质和线粒体蛋白 质提取试剂盒 C500073 亚细胞结构蛋白提 取试剂盒 C500053 植物蛋白提取试剂 盒 C510020 一步法昆虫细胞活 性蛋白提取试剂盒 C510004 一步法植物活性蛋
4、 白质提取试剂盒 C500023 一步法细菌活性蛋 白提取试剂盒 C500006 一步法动物组织活 性蛋白提取试剂盒 C500026 一步法酵母活性蛋 白提取试剂盒 C500022 一步法动物细胞活 性蛋白提取试剂盒 蛋白定量 蛋白定量是做 WB 实验的基础。 蛋白定量的目的是:保证同一组中的不同样本的蛋白总量保持一致,只有这样,wb 结果的 内参、灰度等数据才可信。否则实验数据没有参考价值。 蛋白定量的方法很多,常用的有 Lowry 法、BCA 法、紫外吸收法、Biuret 法、这些方法各 有优缺点。应该按照具体实验选择不同的实验方法进行蛋白定量。 示例:BCA 法蛋白定量 1. 根据样品数量,按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B(50:1)配制适量 BCA 工作 液,充分混匀。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。 2. 完全溶解蛋白标准品,取 10ul 稀释至 100ul,使终浓度为 0.5mg/ml。蛋白样品在什么 溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见,也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀 释标准品。 3. 将标准品按 0, 1,
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