猪卵母细胞冷冻保存研究

1、中国奢牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学本研讨会论文集 猪卵母细胞冷冻保存研究 张德福扎2 刘东“2 王邵凯3 王少兵3 汤琳琳b 2 ( 1 上海市农亚科学院畜牧兽医研究所，上海2 0 11 0 6 ； 2 上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海2 0 1 1 0 6 ： 郭南京农业大学动物科技学院，南京， 2 5 2 1 0 0 ) 捅要：【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素( F D A ) 染色鉴 定卵母细胞冷冻后的存活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同 冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】( 1 ) 程序化法冷冻保存中，3 种冷冻 保护剂乙二醇( E G ) ，二甲基亚砜( D M S O ) ，甘油( G I y ) 均对猪M I I 期卵母细胞有冷冻保护作用，极 显著高于对照组存活率3 3 8 ，2 5 8 ，2 3 5 v s2 5 ，P O 0 1 ) ，且以E G 的效果最好，显著高 于另外睡组( 3 3 8 v s2 5 8 ，2 3 5 ，P 0 0 5 ) 。( 2 )

2、 玻璃微细管( G M P ) 法是猪卵母细胞超低温 冷冻的较好方法，以普通盼麦管( S t r a w ) 法进行的程序化冷冻为对照组，G M P 管法显著提高猪卵母 细胞的冷冻存活率( 分别为5 3 。3 静3 4 。5 ，P 0 。0 5 ) 。( 3 ) 在玻璃化冷冻方法中，幂同的冷冻液栽 体对猪卵母细胞冷冻存活率有影响。以E F S 4 0 为冷冻液，S t r a w 和G M P 管作冷冻液载体，卵母细胞 的存活率分别为4 5 0 和6 5 9 ，二者差异显著( 尸 0 。0 5 ) 。( 4 ) 用S t r a w 的程序化冷冻法和和用 G M P 管的玻璃化冷冻法对猪G V 期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著( 存活率分别为3 0 。O 和 5 9 7 ，尺0 0 5 ) 。冷冻后继续培养，分别有2 8 和6 3 的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。( 5 ) 冷冻 对M I I 期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4 9 的受精卵分裂，极显著低 于对照组的| | 9 5 菇( P 0 0 1 ) ；发育歪4 一细胞期的比例为1 7 ，未能发育互8 一

3、细胞期以上胚胎。 关键词：猪；卵母细胞；冷冻保存；体外受精 近年来，随着动物胚胎生物技术( 如核移植、体外受精、胚胎体外生产等) 的迅速发展，对卵 母细胞的需求日益增加，仅通过回收体内成熟卵母细胞已经无法满足科硪秘生产的需要。蕊从屠宰 场回收废弃卵巢加以利用以获取大量卵母细胞，可望成为一条方便、快捷和有效的途径；猪卵母细 胞冷冻保存有助于我国优良地方猪种种质资源的保护，有助于资源共享与交换。 动物卵母细胞是母系遗传信息的载体，通过冷冻保存动物的卵母细胞，不但可以建立雌性动物 的基因库，还可充分利周卵母细胞资源，使体终受糖、转基因和核移植技术研究不受时阀帮地域的 限制。另方面，通过体矫受精实现胚胎的体外生产，也可为胚胎生物技术提供丰富的材料来源； 通过“试管动物”的生产，为克服珍稀濒危动物的生殖疾病提供良好的解决方案。猪卵母细胞冷冻的 研究还可为丰富低温生物学的理论、方法和实践，提供重要的依据。迄今为止，猪卵母细胞的冷冻 保存仍是一个世界性难题，猪的卵母细胞由于莠旨滴含量离、对低温冷冻十分敏感珏翻。总的看来，相 关的研究资料相对较少，其冷冻解冻后的存活率仍然偏低，长期保存的技术难度仍然很

4、大。本研究 利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、F D A 染色、体外成熟和体外受精等为卵母细胞存 活指标，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。 1 材料与方法 基金硬翻：上海南科技兴农重点攻关顼磊( 沪农科攻字( 2 0 0 3 ) 第1 4 1 号) 、上海市农遭科学院青年科技 基金、德鬟B M B F ( 编号N o ：C H N9 9 3 1 国基金资助。 作者简介：张德福( 1 9 6 3 一) ，男，上海人，研究煲，硕士，研究方向为动物胚胎生物技术研究， 。T e l ：0 2 1 6 2 2 0 0 3 8 9 ，F a x ：0 2 1 6 2 2 0 7 8 5 8 E - m a i l ：z h a n g d e f u l 0 y a h o o c o m c n 串匿畜牧甍医学会动物繁殖攀分会第十三援学术磅讨会论文集 实验中所用的试剂除特殊说明外，均来自S i g m a 公司 l 。t 猪卵母缨脆的采集和体外成熟培养 卵巢采集于上海市长宁区复兴屠宰场。卵母细胞的采集和体外成熟培养按本实验室方法进行【3 “】。 1 2 冷冻液

5、的制备和保存 E F S 4 0 ，E F S 2 0 玻璃纯液：3 0 聚蔗糖( F i c o l l ) 和0 5 m o l L - 1 蔗糖溶予P B S ( 含1 5 F C S ) 中，充分混匀即为F s 液，然后用乙二醇( E G ) 和F s 液按照2 ：8 ( v v ) 和4 ：6 ( v v ) 的比例混匀配 制成E F S 2 0 和E F S 4 0 t s J 。保存于4 。 蔗糖：溶于羯S ( 含1 5 F C S ) 中，使其浓度分剐为0 5m o l 。L 1 ，过滤磊4 0 保存。 乙二醇( E G ) ，二甲基亚砜( D M S O ) ，甘油( G l y ) # 溶于P B S ( 含1 5 F C S ) 中，使E G 浓度 分别为3 、6 、9 ；D M S O 和G l y 浓度分别为5 、1 0 。过滤除菌后4 口保存。 1 3G M P ( g l a s sm i e r o p i p e t t e ) 管静拉依l 将蛊径为0 2 5 - - 0 4 0 c m 的玻璃管在酒精嚣外焰上加热煅烧，当煅烧部分变得很柔软詹，脱离 火

6、焰用双手掇住玻璃管两端迅速向相对的方向牵拉，拉制成2 0 0 - - 3 0 0 1 a m 的微管，用作胚胎或卵母 细胞冷冻载体。 王。4 超低温冷冻 1 4 1 程序化冷冻 ( 1 ) 方法将G V 期或M I I 期卵母细胞在T C M l 9 9 中洗2 3 次，转移到冷冻保护帮 乙二醇， D M S O ，甘油) 中，进行逐步浓度梯度平衡。以乙二醇做冷冻保护剂为例来说明程序化冷冻的过程： 首先将卵母细胞转移到3 乙二醇平衡5 m i n ；再转移到6 乙互醇中，平衡5 m i m 最后转移到9 乙 二醇中，平衡5 m i n ，并装入0 2 5 m l 的塑料麦管，每管含卵母细胞约1 5 枚。装管顺序和各部分的量 分别为：冷冻液( 4 c m ) 。空气( e 。5 c m ) 一含穿母细胞冷冻液( 2 c m ) 空气( O 。5 c m ) 一冷冻液( 4 c r n ) 。 装管完成后，放入已设置好的程序化冷冻仪( C r y o e e l l1 2 0 0 v s e ，S Y L A B 公司) 中。 ( 2 ) 程序化冷冻程序将装有卵母细胞的麦管放入程序化冷冻仪

7、之前，蓑设置冷冻程序和自动 调节初始温度。本法的初始湿度设为筠，后以l ，m i n 的速度降温至- 7 ；在专时棱冰( i c e s e e d i n g ) ，植冰后，在7 * C 保持1 0 m i n ，再以0 5 m i l l 降至3 5 。C 。再在液氮蒸气中平衡3 m i n 或直 接投入到1 9 6 C 液氮降7 J 。 1 4 2 玻璃化冷冻 ( 1 ) 麦管( S t r a w ) 法以E F S 4 0 作为玻璃化冷冻液。G V 期或M U 期卵母细胞经T C M l 9 9 清洗质， 转移到E F S 2 0 中，平衡l m i n ，再转移到数个约1 0 0 1 a 的E F S 4 0 小滴中，每滴约含卵母细胞1 5 枚， 并平衡l m i n 。利用虹吸或注射器吸入麦管。装警颓序为：蔗糖( I c m ) 空气( O 5 c m ) 冷冻液( 2 e r a ) 空气( O 5 e r a ) 含卵母细胞冷冻液( 3 e r a ) 空气( 0 。5 c m ) 冷冻液( 2 c m ) 空气( O 5 e r a ) - 蔗糖( 1 e n a

8、) 。装管完成后，在液氮蒸气中平衡3 m i n 后投入到1 9 6 。C 液氮或直接投入到1 9 6 4 C 液氮。 ( 2 ) G M P 管法卵母细胞平衡( 同上方法) 后，吸入G M P 管。装管时不使用上述蔗糖和空气段， 吸入的物质全部为含卵母细胞的冷冻液。装管完成艇，在液氮蒸气中平衡3 m i n 后投入到一1 9 6 液氮 或盥接投入到1 9 6 液氮。 1 5 解冻 重5 1 程序化法的解冻冷冻保存一段时阀屠，从液氮中取比麦管，在空气中平德1 0 s e e ，再投入 到3 7 C 的恒温水中，平衡2 0 s e e ，擦净附在麦管上的水珠，用带橡皮套的注射器将含卵母细胞的冷 冻液推注于1 0 c m 的塑料皿( 置于3 7 温控台上，下同) 中。用移卵管吸取卵母细胞，转移到低浓 度鳇冷冻液中，进行稀释( s t e p w i s ed i l u t i o n ) ，以下以E G 为侈 | 来说明。先将卵母细胞转移到6 E G 中，平衡5 m i n ；再转移到3 E G 中，平衡5 m i n ；平衡好后，再转移到O 5t o o lL - 1 S u c r

9、o s e ( 蔗糖溶 液) 中平衡5 m i n ；之后，转移卵母细胞至T C M l 9 9 ( 含1 0 F C S ，下同) ，洗涤3 4 次。 1 。5 2 玻璃化法镌解冻玻璃纯法豹解冻较程序化法简单，麦警或G M P 管取般液氮罐并在空气 和3 7 平衡后( 细节同上) ，推注到塑料吼中，用移卵管直接转移到0 5m o lL - 1 蔗糖溶液中平衡5 2 4 2 中围畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十纛屠学术研讨会论文集 I l l l l l l lI l l l l li,I II 皇嬲邕皇皇寡黑_ l 1 0 m i n 。平衡好后洗涤。 1 6 卵母细胞冷冻的效果评价 1 。6 。1 形态学译镎 冷冻簸冻后的辩母细胞经洗涤数次藤敖裂较嵩倍数的倒置显徽镜下麓察，进 行形态学检查。凡能恢复到正常状态，胞质饱满、均一；透明带完整；G V 期卵母细胞外卵丘细胞 未脱落等，视为形态正常网 1 6 。2 继续培养继续培养主要针对G V 麓辩母细胞。对G V 期卵母细施，冷冻。解冻后，在 T C M l 9 9 中洗涤几次后放入平衡好的T C M l 9 9 成熟培养基中继续培养4 4 h ，方法同未冷冻的卵母细 胞培养方法。经培养后的能看到其外卵丘细胞扩散( 扩散，健范围小) ，视为有活力。扩散范恩大( 硝 倍卵母维胞直径) 尝或有多隧避现者，褫为具有发育能力。 1 6 3台盼蓝( T r y p a nb l u e ) 染色法 将洗脱抗冻剂后的卵母细胞转移到0 3 台盼菔中，放在 3 7 温控台上，染色3 m i n ，然后洗涤4 - 5 次，放到实体镜下观察。活的卵母细胞不着色，死的卵 母缨施蓝染。 1 6 4F D A ( 二乙酸楚光素) 染色法 卵母细胞脱除抗冻剂后，放到5 - 1 0 F D A 染色液中，3 7 染色3 m i n ，放到T C M l 9 9 中洗涤3 5 次，立即拿到荧光显微镜下观察。胞质发荧光

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