实验七细胞的冻存和复苏6
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实验7细胞的冻存和复苏【实验原理】在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械 损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保 护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在一130C以下 的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的一50C，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMS O）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿 透细胞。【实验目的】掌握细胞冻存的方法，熟练进行细胞冻存与复苏操作。【仪器、材料及试剂】1. 仪器：4C冰箱，-70C冰箱，液氮罐，离心机，水浴锅，微量加样器等2. 材料：冻存管（塑料螺口专用冻存管或安甑瓶）、离心管、吸管等。3. 试剂：0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）等。【操作步骤】1. 冻存 消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。 1000rpm离心10分钟，弃上清液。 沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5x10切ml左右。 将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 将冻存管口封严。如用安甑瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 按下列顺序降温：室温-4。（20分钟一冰箱冷冻室（30分钟）一低温冰箱（一30C 1小时） 一气态氮（30分钟）一液氮。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立 升的液氮能用11.5月。2. 复苏 从液氮中取出冻存管、迅速置于37C温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融 化。 打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。 1000rpm离心10分钟，弃去上清液。 沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。 加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37C培养，第二天观察生长情况。附：冻存液配制：培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达520%。保护剂的种类和用量视不同细胞 而不同。配好后4C下保存。【实验报告】列出细胞冻存与复苏的详细过程，并注明各过程应注意的事项。【思考题】1 .细胞冻存与复苏的基本原则是什么？2 .冻存液的作用是什么？
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