实验七细胞的冻存和复苏6
实验7细胞的冻存和复苏【实验原理】在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械 损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保 护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在一130°C以下 的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的一50C,细胞仍能生长,活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMS O)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿 透细胞。【实验目的】掌握细胞冻存的方法,熟练进行细胞冻存与复苏操作。【仪器、材料及试剂】1. 仪器:4C冰箱,-70C冰箱,液氮罐,离心机,水浴锅,微量加样器等2. 材料:冻存管(塑料螺口专用冻存管或安甑瓶)、离心管、吸管等。3. 试剂:0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液)等。【操作步骤】1. 冻存 消化细胞(同实验二),将细胞悬液收集至离心管中。 1000rpm离心10分钟,弃上清液。 沉淀加含保护液的培养,计数,调整至5x10切ml左右。 将悬液分至冻存管中,每管1 ml。 将冻存管口封严。如用安甑瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。 贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 按下列顺序降温:室温-4。(20分钟一冰箱冷冻室(30分钟)一低温冰箱(一30C 1小时) 一气态氮(30分钟)一液氮。注意:操作时应小心,以免液氮冻伤。液氮定期检查,随时补充,绝对不能挥发干净,一般30立 升的液氮能用11.5月。2. 复苏 从液氮中取出冻存管、迅速置于37°C温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融 化。 打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。 1000rpm离心10分钟,弃去上清液。 沉淀加10ml培养液,吹打均匀,再离心10分钟,弃上清液。 加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,37C培养,第二天观察生长情况。附:冻存液配制:培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达520%。保护剂的种类和用量视不同细胞 而不同。配好后4C下保存。【实验报告】列出细胞冻存与复苏的详细过程,并注明各过程应注意的事项。【思考题】1 .细胞冻存与复苏的基本原则是什么?2 .冻存液的作用是什么?