（优质课件）HER2基因扩增FISH 典型特殊案例分享.ppt

FISH￿典型特殊案例分享NP-BIO-2015.02-008 Valid Until 2017.021 声明声明 本幻灯片仅以学术交流为目的处方请参考国家食品药品监督管理本幻灯片仅以学术交流为目的处方请参考国家食品药品监督管理总局批准的药品说明书总局批准的药品说明书专业资料，仅供医药卫生专业人士参考 2 背￿￿￿￿景u对来自同一中心的病例（病例数﹥1700）进行研究，发现将近10%的原位杂交结果呈现异常信号形式1u对其中最常见的形式进行了阐释，为诊断者提供了报告指南，并对未来的研究提出了建议u“典型的特殊情况”￿一致性管理，使最终可以得到分子及生物化学证据的支持1. Am J Clin Pathol 2012;137:595-6053 HER2￿检测标准流程流程图4 FISH￿￿评判标准•ASCO/CAP于2013年10月联合发布了新版乳腺癌HER2检测指南1,2•中华病理学杂志于2014年4月发布了新版中国乳腺癌HER2检测指南31.￿Journal￿of￿￿Clinical￿Oncology.￿2013￿Oct￿7.￿[Epub￿ahead￿of￿print]2.￿Arch￿Pathol￿Lab￿Med.￿2013￿Oct￿7.￿[Epub￿ahead￿of￿print]3. 中华病理学杂志2014年4月第43卷第4期5 FISH￿￿评判标准￿中国乳腺癌HER2检测指南（2014版）1：1.￿中华病理学杂志2014年4月第43卷第4期6 FISH￿￿评判标准￿中国乳腺癌HER2检测指南（2014版）1：1.￿中华病理学杂志2014年4月第43卷第4期7 Note•本幻灯收录的病例，均发表于ASCO/CAP指南（2013）和中国指南（2014）发表之前•原作者在讨论病例时，仍然使用了旧版指南中的FISH判读标准。

但是新旧指南的变化并不影响作者的结论•为保证论述的完整性，本幻灯仍然保留原作者的讨论原文•读者在阅读时，应对新旧指南的变化予以注意8 异质性扩增11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-6059 A，图中显示的是两组独立的肿瘤细胞群（由虚线隔开）；一组明显无扩增现象，表明HER2基因的缺失（黄色箭头所示），另外一组的HER2/CEP17比率值﹥2.2，表现为基因扩增（白色箭头所示）10 病例1：简单的异质性扩增在该病例中，来自同一组织的肿瘤细胞，于肿瘤组织切片内，肿瘤细胞可能会立即紧挨放置或在各自的肿瘤区域内一组很明显无扩增现象，另一组的HER2/CEP17比值大于2.2，明显说明基因扩增Solution11 评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释报告建议至少计算每区域中的20个肿瘤细胞该肿瘤包含两个独立的乳腺肿瘤克隆体，其中一个呈现HER2基因扩增现象，另外一个无扩增现象。

将该病例称为呈现“异质性’扩增”的HER2扩增模式，在报告中分别列出两组的HER2/CEP17比值Solution12 “混合”11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60513 B，HER2基因和CEP17拷贝数都有所增加，扩增（HER2/CEP17比率值﹥2.2，白色箭头所示）和非扩增细胞看起来混合在一起，分散在肿瘤区域有些细胞的比率正常，有些扩增明显，但是不可能将两个分开的区域区分开来14 病例2：复杂的异质性扩增“混合”的扩增和非扩增肿瘤细胞在该病例中，扩增和非扩增细胞看起来混合在一起，并分撒在肿瘤区域内有些细胞看起来正常，一些明显扩增，但是无法区别两个不同的区域Solution15 评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释报告建议计数3个区域的60个细胞，并在一张报告单上分别记录扩增和非扩增细胞数目该肿瘤包含混合的乳腺癌克隆体，一个呈现HER2基因扩增现象，另一个呈现非扩增现象。

将该病例称为潜在的“混合异质性扩增模式”，并列出每个计数细胞的HER2/CEP17比值平均值（或在不区分扩增/非扩增的前提下列出每个区域的R2/CEP17比值平均值）然而，虽然现有的数据显示小百分比的扩增细胞并不足以说明HER2扩增的存在，也要列出混合肿瘤群体中扩增细胞（比值﹥2.2）的百分比根据当下的指南，对于这些病例，当所有计数细胞的HER2/CEP17比值平均值过2.2时，可以称之为有HER2扩增现象Solution16 孤立扩增的癌细胞11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60517 C，在非扩增细胞占主导地位的背景下，我们可以看到一个孤立的扩增细胞（白色箭头所示），扩增水平较高（比率值﹥3.0）18 病例3：孤立扩增的癌细胞在该病例中，在非扩增细胞占肿瘤组织主导地位的大背景下，出现比率值明显较大（比值﹥3.0）的孤立细胞值得注意的是，扩增细胞中的信号显而易见，真实可靠，没有人为处理的痕迹。

也许可以逼真地人为模仿一些信号，但多波长的荧光信号（即自荧光）则难以模仿因此，对之评价前，应该确保这些信号在4'，6￿-￿二脒-2￿-￿苯基吲哚示踪剂下或液体过滤器下不显绿色如果这些信号是真的，就应该计数Solution19 只有在细胞明显扩增的情况下才能记录孤立扩增癌细胞的存在该类细胞的预后价值尚不明确，但是当下的证据表明，￿百分比较小（<30%）的情况下，其对结果没有影响列出所有计数细胞的HER2/CEP17比值平均值，并根据该值进行全面的诊断（扩增或非扩增）例如，在该病例中，HER2基因为非扩增评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释报告建议对区域内的扩增或非扩增细胞进行评分时，应该公正评价，不偏不倚该肿瘤可能会包含HER2扩增的孤立细胞，其显著性目前尚未明了然而，当下的证据表明其对预后影响有限我们对之的完全意义尚不明确研究建议——人们认为，获取足够的证据来支撑该孤立癌细胞的预后影响是不大可能的对该类细胞进行生物学的单细胞分析，可能会得到一些信息（运用激光捕获纤维切割），但仍无法阐明其对患者疾病进程的影响￿Solution20 整条17号染色体的缺失11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60521 A和B￿，肿瘤细胞都只带有HER2和CEP17的信号，暗示整条17号染色体区域的完全缺失。

22 病例4：整条17号染色体的缺失在该病例中，在整个肿瘤细胞视野范围内仅可观察到HER2和染色体17CEP信号；实际上，看起来每个细胞都缺失一块整条17号染色体的区域仔细检查发现，相毗邻的正常细胞仍有1到2个CEP17和HER2信号17号染色体CEP的拷贝数目平均值为1.02（标准差，0.13），HER2基因的拷贝数目平均值为1.06（标准差，0.25）；HER2/CEP￿17比值为1.05.Solution23 评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释报告建议根据英国相关指南进行评分尽管该病例异常，很明显，这是一个非扩增肿瘤的例子将该病例称之为HER2非扩增现象，并附上单倍体或17号染色体缺失的可能性研究建议——可以运用比较基因组杂交（CGH）检测缺失的亚染色体区域，该区域的缺失可能会导致HER2和CEP17的缺失Solution24 CEP17￿信号缺失111. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60525 C￿和D，显示的是肿瘤细胞中，HER2拷贝数正常，而17号染色体CEP信号缺失的现象。

结果为临界的HER2基因扩增26 病例5在该病例中，肿瘤细胞缺失17号染色体CEP信号（又可看到毗邻的正常细胞呈现正常的信号模式）HER2拷贝数正常，仅可观察到17号染色体CEP17信号的缺失结果是，HER2基因扩增与否不大明确，HER2拷贝数目平均值为1.98（标准差，0.62），CEP17拷贝数的平均值为1.02（标准差，0.13）；HER2/CEP17￿比值为1.95计数的60个细胞中，该病例可称之为“临界但非扩增”现象，根据美国临床肿瘤学协会/美国病理学家研究院指南，该病例可称之为不确定如果60个细胞中，有6个（10%）及以上细胞的HER2/CEP17比值为2.20，即使每个细胞中HER2拷贝数平均值小于2，根据美国病理学家研究院指南，也将之视为呈现异质性HER2基因扩增现象￿然而，相关研究结果显示，HER2/CEP17比值为2.2及以上的细胞数高达30%时，对结果没有影响Solution27 评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释从HER2/CEP17比值来看，该病例为非扩增肿瘤。

HER2复制水平低下，是否出现如例4所示的整条17号染色体缺失，尚不明确一条染色体上带有CEP17α~卫星的特定着丝粒区域缺失与否也有待查明很可能这是染色体重排和失衡的结果其它可能性（也可见于细胞遗传学中的其它实体瘤）包括1条17号染色体的缺失（17号染色体长臂上一个等臂染色体的形成）和不平衡置换（保留包含17q物质和HER2核心的衍生染色体）低水平“扩增”的小百分比(<30%)细胞的存在，没有显著性差异，不予以报告呈现17号单倍体的病例对曲妥珠单抗的反应性较差因为其为低水平扩增事件，至少要计数60个细胞Solution28 报告建议根据扩大细胞计数量，使之不少于60得到的结果，该病例可称为非扩增现象可以在附录中注明CEP17正常的计数比值≥2.2的小数量细胞的出现无明显差异，不应该对其进行报告研究建议——进行大批比较基因组杂交/多重连接探针扩增￿(CGH/￿MLPA)￿来测定17号染色体的拷贝数和HER2基因扩增的地位￿Solution29 CEP17信号的缺失211. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60530 ￿A￿和￿B￿，肿瘤细胞中仅有一个CEP17的拷贝体，然而，HER2拷贝数增加，导致扩增比值。

31 病例6在该病例中，CEP17的出现与例5具有可比性，暗示肿瘤细胞中1个CEP17信号的缺失（再次与呈现正常信号模式的正常细胞毗邻）信号缺失或减少仅涉及CEP17信号；然而，该病例中也呈现出HER2拷贝数目的增加结果为，HER2基因扩增，HER2的拷贝数目平均值为5.75（标准差，0.9），CEP17拷贝数为1（标准差，0.0）；HER2/CEP17比值为5.75Solution32 从HER2/CEP17比值看，很显然，其为扩增细胞是否出现如例5所示的整条染色体缺失（HER2在剩下的染色体上扩增），或是否有特定的着丝粒区域缺失（在一条染色体包含CEP17α~卫星），尚不清楚如果后者正确，该类型的病例中不包括真正扩增然而，我们当今的观点是，这代表了带有HER2基因扩增的17号染色体单倍体数目的减少——由于染色体组型高度复杂，17号染色体长臂多次拷贝，HER2扩增可出现在保留的染色体上或增加拷贝的HER2基因没有证据表明计数多余的细胞会改变诊断结果，根据指南计数至少20个细胞。

评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释Solution33 该病例为HER2基因扩增，并列出HER2/CEP17比值，应在附录注上异常CEP17出现的计数报告建议研究建议——可以进行一系列的CGH/MLPA￿来决定17号染色体数目的拷贝数和HER2基因扩增的地位应视方案的不同，对CGH进行区别Solution34 CEP17信号完全缺失11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60535 C￿和D，CEP17信号在肿瘤细胞中看不到，然而，在正常细胞中可见(箭头所示)，在该病例中，HER2扩增地位仅由HER2拷贝数决定36 病例7在该病例中，肿瘤细胞中，所有的CEP17信号完全缺失；注意一个重要的对照是正常细胞中含CEP17只有当正常细胞中出现CEP17信号的时候才可以明确的做出CEP17缺失的诊断如果正常细胞中没有CEP17信号，则是原位杂家评价的技术失误。

因为没有CEP17，则无法得到HER2/CEP17比值，这无疑带来了些许挑战HER2的平均拷贝数为6.8￿/细胞(标准差，1.78)Solution37 推荐所有病例使用CEP17，而不推荐使用单一的拷贝荧光原位杂交￿FISH曲妥珠单抗大型Ⅲ期试验的报告结果都不是以拷贝数目来记录的，相关研究也说明拷贝数目在HER2基因扩增指导中作用不大然而，在极少数情况下，当染色体的着丝粒区域缺失时，建议以大于等于6的拷贝数来记录缺失CEP17区域的HER2扩增现象这并不是最佳的记录方法，而且不能根据以往的证据，延伸到非缺失CEP17的病例然而，在这些特殊的病例中，当下并不推荐分析CEP17评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释计数肿瘤细胞中的HER2基因拷贝数证据表明诊断结果与计数细胞多少无关根据指南计数细胞的最小值为20Solution38 报告建议——仅根据HER2基因拷贝数（仅当HER2基因数目≥6/细胞时），将该病例为扩增并做个注释以说明和所有细胞中的CEP17信号缺失报告建议研究建议——进行大批的CGH/MLPA￿可以阐明基因损伤导致的CEP17信号缺失，并决定HER2基因扩增地位的有无。

使用替代17号染色体的探针（端粒探针）进行荧光原位杂交FISH分析也具有一定的价值Solution39 信号重叠共存11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60540 HER2和￿CEP17拷贝数目很高￿A和B，HER2和CEP17￿的拷贝数目非常高，信号重叠共存，呈现出黄色融合信号41 病例￿8该病例中，细胞内呈大量的HER2和CEP17共存的信号模式，用三带通滤波器观察时，红绿融合的信号呈黄色在高强度下，可以观察到红绿信号重叠使用单带通滤波器，可以确认信号的重叠共存￿并排除人为因素￿(荧光通过所有的带宽)对该病例进行诠释有些困难，因为其HER2/CEP17￿比值为1.04，HER2和CEP17信号的计数平均值分别为24.3和23.43，根据传统标准应为非扩增然而，HER2/CEP1的高拷贝值却意味着该病例高度异常Solution42 评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释用单色过滤器对HER2和CEP17信号进行评分，注意区域内细胞的匹配，以确保红绿信号的精确计数。

根据指南计数至少20个细胞；计数多余的细胞不可能改变诊断结果其为异常病例，因为即使HER2/CEP17比值表现为非扩增模式，HER2和CEP17都有很高的拷贝数鉴于有证据表明HER2/CEP17扩增子的程度不同，11我们认为，这些病例可能代表了HER2扩增子扩展到CEP17着丝粒外围区域我们认为这些罕见的病例解释为扩增现象信号模式可解释为HER2扩增子延伸到着丝粒，并整合了着丝粒周边区域，导致了CEP17信号与HER2信号的重叠共存已有初步证据证明，带有扩展HER2扩增子的患者可能会对曲妥珠单抗12的反应敏感性降低；然而，该假设还未得到进一步证实Solution43 该病例应称之为基于HER2拷贝数的着丝点和相关平衡的CEP17拷贝数的共扩增，并在报告中注明HER2￿和CEP17信号的重叠共存现象报告建议研究建议——要对一系列此类病例进行CGH/MLPA，以验证CEP17和HER2重叠共存的设想Solution44 信号分离11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60545 C和D，HER2和CEP17的拷贝数都增加了，但信号分离。

46 病例￿9在该病例中，HER2￿和CEP17的拷贝数很高，但呈现的是非重叠的分离信号从HER2/CEP17比值看，为非扩增模式￿(1.12)；然而，此图却显示，HER2￿和￿CEP17的拷贝数目皆有升高，分别为7.45和6.65Solution47 因为HER2/CEP17￿比值显示为非扩增，该病例解释起来可能看似简单直接；然而；HER2和￿CEP17￿信号却显示较高的拷贝数HER2￿拷贝数目≥6（较为多见，但不大整齐一致），则提示HER2扩增现象，通过单一拷贝计数法分析，￿则将之称为扩增现象从遗传学角度看，HER2和CEP17拷贝数目增加到该水平，明显而平衡，其根本机制尚不清楚，但也不可能反映出17号染色体的多个完整无缺的复制而因为这些病例的真正的分子机制不确定性，在解读FISH结果时，仍有做出错误诊断的巨大空间在缺失明确证据（如HER2/CEP17信号共存）证明HER2/CEP17信号共扩增时，很难认定其为真正的HER2扩增现象事实上，这些病例可能代表了带有亚染色体复制病例的混合，而且，其中一小部分病例可能为真正扩增。

然而，目前，仍没有足够的证据表明这些病例可以从治疗中获益评分建议诠￿￿￿￿￿￿￿释对HER2和CEP17信号进行评分，根据相关指南，计数细胞至少为20个Solution48 报告建议研究建议——应对大量此类病例进行一系列的CGH/￿MLPA分析，测定该类病例的根本遗传机制，并判断其是否代表了HER2的扩增另外还可以看一下HER2￿mRNA的定量聚合酶链式反应来确定基因的扩增状况根据现行指南，该病例该记录为非扩增报告中应对HER2￿和CEP17￿的高拷贝数进行评价Solution49 黄色融合信号11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-60550 A：HER2和CEP17信号共存导致的黄色融合信号当捕获HER2￿(B)￿CEP17￿(C)信号，并将之作为独立的图像而进行比较时，在核的同一个区域信号呈明显的共存现象51 HER2￿和CEP17的共扩增HER2/CEP17共扩增虽然很少见，在当今诊断界仍是人们讨论的重点话题。

在本次研究中，1787例病例中仅有2例（0.1%）呈CEP17和HER2￿“共存”现象￿HER2和CEP17的FISH标记重叠，呈现出黄色的“合并”信号，即为CEP17和HER2￿的“共存”现象然而，更多的病例，22￿例(1.2%)，呈现出高HER2拷贝数（≥6/细胞）和CEP17复制信号，以至于整体的HER2/CEP17比值不超过2.2￿由于证据不足，难以支撑诊断结果，所以阐明这些病例仍有难度52 Question1-￿图片中的问题所在？A￿信号分离￿￿￿B￿多倍体2-￿此案例是否扩增？￿A￿扩增￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿B￿非扩增53 We Innovate Healthcare54 。