专题04 DNA和蛋白质技术 高考生物生物技术实践专项突破（选修1）.pptx

选修一生物技术实践知识精讲及高考真题专题04 DNA和蛋白质技术血红蛋白的提取和分离（精）多聚酶链式反应扩增DNA片段（略）DNA的粗提取与鉴定（略）010203CONTENTS目 录DNADNA粗提取、粗提取、PCRPCR技术、技术、蛋白质分离蛋白质分离比较比较DNA的粗提取与鉴定PCR技术分离蛋白质实验原理DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精利用DNA热变性原理体外扩增DNA依据相对分子质量的大小不同来分离蛋白质实验实验过程过程选取材料选取材料破碎细胞，释破碎细胞，释放放DNADNA除杂除杂DNADNA析出与析出与鉴定鉴定变性变性复性复性延伸延伸样品处理样品处理凝胶色谱操凝胶色谱操作作实验实验结果结果获得较纯净的获得较纯净的DNADNA获得大量获得大量DNADNA片段片段相对分子质量不同的蛋相对分子质量不同的蛋白质得以分离白质得以分离实践实践意义意义为为DNADNA研究打下基础研究打下基础解决了解决了DNADNA研究中材研究中材料不足的问题料不足的问题为蛋白质的研究和利用为蛋白质的研究和利用提供了原材料提供了原材料凝胶色谱法与电泳法凝胶色谱法与电泳法比较比较凝胶色谱法凝胶色谱法电泳法电泳法原理原理根据相对分子质量大小根据相对分子质量大小进行分离进行分离根据相对分子质量大小根据相对分子质量大小和带电性质进行分离和带电性质进行分离介质介质 凝胶柱、缓冲液凝胶柱、缓冲液电极、缓冲液电极、缓冲液特点特点相对分子质量较小的分相对分子质量较小的分子进入凝胶内部，路程子进入凝胶内部，路程长，移动慢；较大的在长，移动慢；较大的在外部移动，路程短，移外部移动，路程短，移动快动快分子带电性质的差异以分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度产生不同的迁移速度结果结果物质分离物质分离溶解规律溶解规律2 mol/L NaCl溶液溶液0.14 mol/L NaCl溶液溶液DNA溶解溶解析出析出蛋白蛋白质质NaCl溶液浓度从溶液浓度从2 mol/L降降低的过程中，蛋白质溶解度低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大逐渐增大部分发生部分发生盐析沉淀盐析沉淀溶解溶解方法步骤加入物质目的1.制备鸡血细胞液柠檬酸钠溶液防止血液凝固2.提取鸡血细胞细胞核物质20ml蒸馏水加速血细胞破裂3.溶解细胞核内的DNA2mol/L的NaCl溶液溶解DNA4.析出含DNA的粘稠物蒸馏水使2mol/L的NaCl溶液稀释至0.14mol/L使得DNA最大限度地释出5.滤取含DNA的粘稠物使含DNA的黏稠物被留在纱布上6.将DNA的粘稠物再溶解2mol/L的NaCl溶液溶解DNA7.过滤含DNA的NaCl溶液除去含DNA的滤液中的杂质8.提取含杂质较少的DNA冷却的95%的冷酒精提取DNA9.DNA的鉴定2mol/L的NaCl溶液二苯胺（沸水浴）出现蓝色PCR的概念PCR全名是反应，它是一种迅速扩增DNA片断的技术，其特点是以极少量的为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。

PCR扩增的条件及原理1.PCR扩增的方向：通常将DNA的羟基（OH）末端称为，而磷酸基团末端称为DNA的合成方向总是从子链的延伸3端多聚酶链式体外DNA5端5端向3端PCR反应的条件：PCR反应需要在中才能进行，需提供：DNA模板，四种脱氧核苷酸，同时要控制温度PCR扩增的过程：反应的每一轮循环都包括、和延伸三步1）变性：温度以上，双链DNA在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2）复性：温度下降到50左右，两种引物通过与两条单链DNA结合3）延伸：温度上升到左右，在聚合酶的作用下，以四种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则，从引物的53端延伸合成与模板互补的DNA新链一定的缓冲溶液引物变性耐热的DNA聚合酶复性90碱基互补配对72DNA课题3 血红蛋白的提取和分离一、样品处理和粗分离二、纯 化三、纯度鉴定1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白凝胶色谱法凝胶色谱法SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳血红蛋白的组成 亚铁血红素基团可携带一分子O2或一分子CO21.洗涤红细胞血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2 min红细胞血 浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色洗涤目的：洗涤目的：除去杂蛋白，除去杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化以利于后续血红蛋白的分离纯化洗涤干净的标志：洗涤干净的标志：直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。

直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净2.释放血红蛋白1.蒸馏水的作用是_2.加入甲苯的作用是_3.充分搅拌的目的是_使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂3.分离血红蛋白滤纸过滤脂类物质分离过程红细胞混合液高速离心10min 离心管烧杯有机溶剂血红蛋白有机溶剂（无色透明的甲苯层）脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）4.透析血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液透析的目的是什么？去除血红蛋白中的小分子杂质透析袋是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，仍然留在袋内，蛋白质周围的小分子可以与缓冲液进行交换，通过多次更换透析液，就可除去蛋白质周围的小分子蛋白质的分离1.凝胶色谱法概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢材料：凝胶凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖内部有许多贯穿的通道.2.凝胶电泳法概念：电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

常用电泳方法：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入带负电荷多的加入带负电荷多的SDS，形成，形成“蛋白质蛋白质SDS复复合物合物”，使蛋白质，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小迁移速率仅取决于分子大小纯化凝胶色谱操作1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的加入和洗脱步骤操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-75 20mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？G表示凝胶的交联程度，膨胀范围及分离范围75表示凝胶得水值注意注意：色谱柱不能内不能有色谱柱不能内不能有气泡气泡；装完后，立即用缓冲液洗涤，凝胶装完后，立即用缓冲液洗涤，凝胶装填紧密装填紧密样品的加入和洗脱 1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集缓冲液凝胶 加样注意：(1)不要触及破坏凝胶面(2)贴壁加样(3)使吸管管口沿管壁环绕移动注意事项1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

2.色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流3.凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动5.在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能蛋白质的提取和分离步骤1、样品处理通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集血红蛋白溶液2、粗分离经过透析去除分子量较小的杂质3、纯化通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白质除去4、纯度鉴定通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定1、(2019年江苏卷)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述,错误的是A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNAD.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热高考真题训练答案：A【解析】哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和细胞器,不能提取到DNA;鸡血、菜花、豌豆、菠菜等都具有细胞核,可以通过不同的方法提取DNA,用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量差异很大,A错误为防止DNA断裂,在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向,B正确。

DNA不溶于洒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精溶液,预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA,C正确在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,因此,用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热,D正确2、（2015江苏卷.25）图1、2 分别为“DNA 的粗提取与鉴定”的实验中部分操作步骤示意图,下列叙述正确的是（）A.图1、2 中加入蒸馏水稀释的目的相同B.图1 中完成过滤之后保留滤液C.图2 中完成过滤之后弃去滤液D.在图1 鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质答案：BCD【解析】图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破,图2中加入蒸馏水的目的是调节盐溶液的浓度,使DNA析出;图1中鸡血细胞破裂后DNA位于滤液中;图2申析出的DNA在纱布上,应弃去滤液;嫩肉粉中含有木瓜蛋白酶,能使杂质蛋白分解3、(2014江苏)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验叙述,错误的是A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料B.DNA既溶于2 mol/L Nacl溶液也溶于蒸馏水C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,可见玻棒上有白色絮状物D.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后变蓝答案：C【解析】本题考查DNA的粗提取和鉴定实验,意在考查考生对实验原理的理解和对实验操作要求的掌握情况。

原则上含DNA的生物材料都可用来提取DNA,只是选用DNA含量高的生物组织,成功的可能性更大;DNA在2 mol/L NaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大;向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌,鸡血细胞会吸水破裂,但在蒸馏水中不会析出DNA;DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热,待冷却后溶液变蓝4、(2013江苏)某同学用洋葱进行DNA粗提取和鉴定实验,操作错误的是A.加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨B.用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNAC.加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌D.加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热答案：A【解析】本题考查DNA粗提取和鉴定实验的操作要领,意在考查考生的实际操作与分析理解能力加入洗涤剂后研磨动作要轻缓、柔和,否则会产生许多泡沫,不利于后续步骤的操作,A错误;蛋白酶能够分解蛋白质,因此能起到纯化DNA的作用,B正确;加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀,C正确5、(2013北京)关于高中生物学实验的基本原理,叙述不正确的是A.噬菌体须在活菌中增殖培养是因其缺乏独立的代谢系统B.提取组织DNA是利用不同化合物在溶剂中溶解度的差异C.成熟植物细胞在高渗溶液中发生质壁分离是因为细胞壁具有选择透(过)性D.PCR呈指数扩增DNA片段是因为上一轮反应的产物可作为下一轮反应的模板答案：C【解析】噬菌体为病毒,其生命活动离不开活细胞,因为其缺乏独立的代谢系统,A项正确;DNA的粗提取实验中,利用DNA和蛋白质等在不同浓度的氯化钠溶液或酒精溶液中的溶解度不同,而达到将其分离的目的,B项正确;成熟植物细胞在髙渗溶液中发生质壁分离是因为其原生质层具有选择透(过)性,植物细胞的细胞壁是全透性的，C项错误;PCR技术的原理类似DNA的复制,上一轮反应的产物可作为下一轮反应的模板进行复制,D项正确。

6、(2011广东)以下关于猪血红蛋白提纯的描述,不正确的是A.洗涤红细胞时,使用生理盐水可防止红细胞破裂B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核,提纯时杂蛋白较少C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D.在凝胶色谱法分离过程中,血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢答案：D【解析】本题考查血。