中药化学3.4 香豆素类化学成分的提取分离技术.ppt

3.4 香豆素类化学成分的提取分离技术,1、基本母核：苯骈α-吡喃酮（色原酮的异构体）（邻羟桂皮酸内酯）,一、结构与分类,3.4.1 必备知识,具有芳香气味，广泛分布于高等植物中，在生物体内以邻羟基桂皮酸苷的形式存在，酶解后苷元邻羟基桂皮酸内酯化成香豆素，具有荧光性及多种生物活性一、结构与分类,2、分布香豆素类在动植物及微生物中均有分布，如致癌成分黄曲霉素类及发光真菌中的亮菌素类均属于香豆素类这类成分分布得最广的还是高等植物中，其中芸香科和伞形科中分布最多它们在植物体内以游离状态或与糖结合成苷的形式存在，苷酶解可环合成游离的内酯状态一、结构与分类,3、香豆素的结构类型香豆素母核的苯环或α-吡喃酮环上常有羟基、烷氧基、苯基、异戊烯基等取代，其中异戊烯基的活泼双键又可与邻位酚羟基环合成呋喃或吡喃环结构，根据其取代基及连接方式不同，把香豆素分成几类：,（一）简单香豆素类,指只有在苯环上有取代基的香豆素类如白蜡树枝皮,苯环上有取代基,白蜡树的枝皮或干皮的主要成分：七叶内酯和七叶苷,（二）呋喃香豆素类,香豆素核上的异戊烯基与邻位酚基环合成呋喃环，成环后常伴随着降解失去三个碳原子1）直线型：C6-异戊烯基与C7-羟基环合而成（6、7呋喃骈香豆素型）如：补骨脂内酯 （2）角型：C8-异戊烯基与C7-羟基环合而成（7、8呋喃骈香豆素型）如：异补骨脂内酯,（三）吡喃香豆素类,香豆素的C6或C8异戊烯基与邻酚羟基环合而成2、2-二甲基-α-吡喃环结构。

1）直线型： C6-异戊烯基与C7-羟基环合而成（6、7吡喃骈香豆素）如：美洲花椒根皮；（2）角型： C8-异戊烯基与C7-羟基环合而成（7、8吡喃骈香豆素）如：印度邪蒿的果实美洲花椒,（四）其它香豆素类α-吡喃环上有取代基的香豆素类C3、C4上常有苯基、羟基、异戊烯基等取代C3苯代香豆素生源同黄酮茵陈蒿,生理活性,1.毒性：肝毒性 必要结构：呋喃环上的双键和不饱和内酯环 2. 抗菌作用：秦皮中的七叶内酯和七叶内酯苷具抑制痢疾杆菌的作用补骨脂内酯具抗真菌及抗结核活性 3.平滑肌松弛作用：血管扩张作用 伞形科凯刺：冠状动脉扩张； 茵陈蒿滨蒿内酯：解痉利胆； 4.抗凝血作用和止血作用： 双香豆素：防血栓及消血块；泽兰内酯：止血5.光敏作用 补骨脂内酯治疗白癜风 呋喃香豆素多有该作用很多香豆素可以吸收紫外光，放出在可见区（近470nm）的荧光，故可用做增白剂，如7-OH香豆素由于吸光性，七叶内酯和七叶苷可用于保护皮肤防止辐射的药物二、理化性质,（一）性状游离苷元：无色至淡黄色结晶，具有芳香性和挥发性；苷类：粉末状，多数无香味和挥发性 （二）溶解性游离苷元：溶于沸水，但不溶于冷水。

溶于氯仿、乙醚、醋酸乙酯、丙酮、甲/乙醇等有机溶剂苷：易溶于甲/乙醇，可溶于水，难溶于乙醚、氯仿、醋酸乙酯等有机溶剂三）内酯性质和碱水解反应,1、香豆素的α-吡喃酮环具有α，β-不饱和内酯性质，在稀碱液中会逐渐水解生成顺邻羟桂皮酸的盐，而顺邻羟桂皮酸不易游离存在，其盐的水溶液经酸化即闭环恢复成内酯这个闭合过程极易发生，即使在很弱的酸溶液中，如通入CO2也能促使其内酯化而闭环2、香豆素如果和碱液长时间加热，水解产物顺邻羟桂皮酸衍生物则发生异构化，转变成反邻羟桂皮酸的盐，再经酸化也不再发生内酯化闭环反应 香豆素内酯环发生碱水解的速度主要与C7位取代基的性质有关四）荧光性,香豆素母体本身即无取代的香豆素并无荧光羟基香豆素类化合物在紫外光下大多显蓝色或蓝绿色荧光，在碱液中更加显著，尤其是C7羟基香豆素，甚至在日光下也可辨认若在C8或C6再引入羟基，则荧光减弱引入甲氧基后荧光也将减弱，颜色转变为紫色三、检识方法,香豆素类分子中均具有内酯结构，通常还具有酚羟基或内酯水解后产生的酚羟基，通过这些基团的显色反应，能为检识与鉴别香豆素成分提供参考1、异羟肟酸铁试验（内酯的颜色反应）具有内酯结构，在碱性条件下内酯开环，与盐酸羟胺缩合成异羟肟酸，在酸性条件下再与Fe3+络合生成异羟肟酸铁显红色。

2、酚羟基反应 （1）与三氯化铁的乙醇液反应，产生绿色现象，取代基越多，颜色越深2）若酚羟基邻、对产生的酚羟基对位无取代基，或水解后基，可与一些试剂缩合显色1）重氮化试剂（如重氮化对硝基苯胺）缩合显红至紫红色 2）与Gibbs试剂（2、6-二氯苯醌氯亚胺）缩合显蓝色 3）与Emerson试剂缩合显红色Emerson试剂：4-氨基安替比林和铁氰化钾3、色谱检识,1、TLC 常用的吸附剂是硅胶，其次是纤维素和氧化铝； 一般采用中等极性的混合溶剂或偏酸性的混合溶剂 显色方法：首选观察荧光，或用氨熏，喷10%氢氧化钠后再观察2、PC常用水饱和的正丁醇、异戊醇、氯仿为展开剂；展开剂的PH值可影响弱酸性香豆素的Rf值3.4.2 香豆素的提取与分离,一、提取1、水蒸气蒸馏法2、碱溶酸沉法3、溶剂提取法 二、分离1、酸碱分离法2、色谱法,（二）香豆素的分离,酸碱分离法：弱酸性和中性香豆素的混合物，可利用碱水酸沉法分离色谱法：柱色谱分离中多采用硅胶吸附剂，慎用氧化铝，否则会使香豆素结构发生变化此外还可用葡聚糖凝胶色谱进行分离分步结晶法：该方法适用于含量较高的香豆素可利用含氧香豆素在石油醚中溶解度小的特点，在含香豆素的乙醚提取液中，逐步加人石油醚，使香豆素逐步析出。

真空升华法：香豆素类易升华的性质使之与不挥发性成分分开对于热稳定性好的香豆素，此法是非常方便实用的但对于热不稳定的香豆素往往会因此引起重排或降解溶剂提取法,1、定义按极性由小到大的顺序选用不同极性的溶剂组成溶剂系统，依次提取分离提取液中各种不同成分，使各溶解度有差异的成分得到分离2、该法的特点：可分离不同极性的有效成分（初始研究阶段） 3、该法的缺点：繁琐，分离纯化度不高，灵敏性下降,中药化学成分及其较适用范围的提取溶剂,,,系统溶剂法： 用石油醚、苯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮和甲醇依次提取样品2、水蒸气蒸馏法某些小分子的香豆素类具挥发性可用蒸馏法与不挥发性成分分离，常用于纯化过程3、碱溶酸沉法,此系经典方法 1.具酚羟基的香豆素类溶于碱液加酸后可析出 2.香豆素的内酯环性质，于碱液中皂化成盐而加酸后恢复成内酯析出碱液加热开环时，要注意碱液的浓度和加热时间，否则将引起降解反应而使香豆素破坏，或者使香豆素开环而不能合环 对酸碱敏感的香豆素用此法可能得到次生产物两相溶剂萃取法,1、原理 ：利用混合物中各种成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的差异而达到分离的目的1）分配系数（K值）与萃取次数的关系K=C u/C l K值与萃取次数成反比， K值越大，萃取次数越少，反之越多各种成分在两相当中溶质的浓度相差越大，即分配系数K差异越大，则分离效果就越好。

2）分离因子（β值）与分离难易的关系β = KA / KB β值越大，越易分离；β值 → 1时，无法分离,分配色谱法,分配色谱法,,基本原理,,正 相 分 配 色 谱,,,反 相 分 配 色 谱,,正相 色谱,极性物质吸附强,,非极性物质吸附弱,后出,先出,反相 色谱,,,极性物质吸附弱,非极性物质吸附强,先出,后出,（一）基本原理 （二）支持剂 （三）分配色谱种类正相分配色谱 反相分配色谱 （四）操作方式1.纸色谱2.分配薄层色谱3.分配柱色谱,单项选择题 1、下列化合物具有强烈天蓝色荧光的是A.七叶内酯 B.大黄素 C.大豆皂苷 D.甘草酸 2、异羟肟酸铁反应的现象是A.绿色 B.蓝色 C.红色 D.黑色 3、FeCl3试剂反应的条件是A.内酯环 B.酚羟基 C.芳环 D.甲氧基,,4、异羟肟酸铁反应作用的基团是A. 酚羟基 B. 芳环 C. 甲氧基 D. 内酯环 5、秦皮中的七叶内酯属于下列哪类香豆素成分A.异香豆素 B.简单香豆素 C.吡喃香豆素 D.呋喃香豆素 6、香豆素的基本母核是A.苯丙素 B.顺式邻羟基桂皮酸 C.苯并α-吡喃酮 D.桂皮酸衍生物 7、下列化合物脱水后能生成香豆素的是A. 桂皮酸衍生物 B. 苯并α-吡喃酮 C. 顺式邻羟基桂皮酸 D. 苯丙素,8、游离香豆素可溶于热的氢氧化钠水溶液是由于其结构中存在A.酚羟基对位的活泼氢 B.酮基 C.甲氧基 D.内酯环 9、异补骨酯素属于A.呋喃香豆素 B.简单香豆素 C.吡喃香豆素 D. 异香豆素 10、七叶内酯具有A.升华性 B.香味 C.两者均无 D.两者均有,,,,,多项选择题 1、含有香豆素的中药有A.秦皮 B.厚朴 C.五味子 D.补骨脂 E.大黄 2、游离的小分子香豆素提取可用A.碱溶酸沉淀法 B.水蒸气蒸馏法 C.色谱法 D.升华法 E.有机溶剂法 3、提取游离香豆素的方法有A.酸溶碱沉法 B. 乙醚提取法 C. 碱溶酸沉淀法 D.热水提取法 E.乙醇提取法,3.4.3 应用,一、秦皮 秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树、白蜡树、尖叶白蜡树、宿柱白蜡树的干燥枝皮或干皮。

味苦，性寒归肝、胆、大肠经有清热解毒、收涩、明目之功效 秦皮中主要含有香豆素类化合物：七叶苷及七叶树内酯（七叶素）、秦皮苷、秦皮素、紫丁香苷等秦皮中七叶内酯和七叶苷的提取分离工艺流程,,以95%乙醇为溶剂提取； 浓缩液加热后用氯仿洗涤，除去脂溶性杂质； 利用七叶苷和七叶内酯在醋酸乙酯中的溶解度不同而分离实训目的】 1.能够运用回流和连续回流法、减压浓缩法对秦皮中七叶苷和七叶内酯进行提取和精制 2.会用显色反应、色谱法进行香豆素类成分的检识 【化学成分概述】秦皮为木樨科植物白蜡树、苦枥白蜡树、尖叶白蜡树、宿柱白蜡树的干燥枝皮或干皮秦皮主要含七叶内酯、七叶苷、秦皮素、秦皮苷等，结构见前述 【实训原理】本实验是根据秦皮中的七叶内酯、七叶苷均能溶于沸乙醇，可用沸乙醇将两者提取出来，然后利用两者在醋酸乙酯中的溶解度不同进行分离 【设备、仪器及药品】索氏提取器、分液漏斗、50ml圆底烧瓶、冷凝管、水浴锅、硅胶G薄层板、紫外光灯（254nm）、95%乙醇、氯仿、醋酸乙酯、盐酸、盐酸羟胺、甲醇、氢氧化钠、三氯化铁、正丁醇、醋酸、秦皮苷标准品实训 秦皮中七叶苷和七叶内酯的提取、分离和鉴定,1、七叶内酯、七叶苷的提取分离 秦皮粗粉150g置索氏提取器中，用乙醇回流提取4次，减压浓缩，回收乙醇，得浓缩物。

浓缩物用水温热溶解加等体积氯仿萃取2次，除去非极性杂质水液挥取残留的氯仿，加等体积的醋酸乙酯萃取2次合并萃取液水液浓缩析晶滤过，甲醇、水反复重结晶得七叶苷醋酸乙酯液加无水硫酸钠脱水，减压蒸干，残留物用甲醇溶解，适当浓缩后放置过夜析晶滤过，水、甲醇反复重结晶的七叶素 2、鉴定（1）荧光：取样品少量，加入乙醇0.5ml ，用毛细管滴于滤纸上，在紫外灯下观察2）三氯化铁反应：取样品少量，加入乙醇0.5ml ，加入1%三氯化铁试剂2～3滴，观察颜色变化操作步骤】,,,,（3）内酯的颜色反应：取样品少量，加0.5ml乙醇溶解，加10%盐酸羟胺甲醇溶液数滴，10%氢氧化钠5～6滴，水浴加热2分钟放冷后加5%盐酸数滴（pH 3～4），加5%三氯化铁2～3滴，观察颜色变化 （4）薄层检识 吸附剂：硅胶GF254薄层板 样品：秦皮提取物1%甲醇溶液 对照品：2%秦皮甲素标准品甲醇液；2%秦皮乙素标准品甲醇液 展开剂：三氯甲烷-甲醇-甲酸（6∶1∶0.5） 显色：三氯化铁-铁氰化钾试液（1∶1）,。