第六章光学检测技术-张静1教学案例.ppt

第六章第六章 光学检测技术光学检测技术利用物质所具有的各种光学性质，对物质利用物质所具有的各种光学性质，对物质进行定性、定量及结构分析的技术进行定性、定量及结构分析的技术包括：旋光检测、荧光检测、分光光度检包括：旋光检测、荧光检测、分光光度检测、散射光谱检测等测、散射光谱检测等生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、荧光检测荧光检测第一节第一节 旋光检测技术旋光检测技术利用旋光计测量出利用旋光计测量出旋光物质（光学活性物质）旋光物质（光学活性物质）对对偏振光偏振光旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，旋转角度的方向（左旋或右旋）和大小，从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物质的质的固有特性固有特性偏振光旋转的方向和角度称为旋偏振光旋转的方向和角度称为旋光度左旋（），右旋（）左旋（），右旋（）物质的旋光度主要取决于物质的旋光度主要取决于物质本身的结构物质本身的结构，此外，此外与入射光的与入射光的波长及温度波长及温度有关，对溶液而言，还与有关，对溶液而言，还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关系。

有密切关系 旋光法：应用旋光仪测量旋光性物质旋光法：应用旋光仪测量旋光性物质的旋光度以确定其含量的分析方法的旋光度以确定其含量的分析方法 旋光度和比旋光度是旋光性物质的旋光度和比旋光度是旋光性物质的主要物理性质通过旋光度和比旋主要物理性质通过旋光度和比旋光度的测定，可以检查光学活性化光度的测定，可以检查光学活性化合物的合物的纯度纯度，也可以定量分析有关，也可以定量分析有关化合物溶液的化合物溶液的浓度浓度 通常用以下两种方法产生偏振光：通常用以下两种方法产生偏振光：尼科尔棱镜或偏振片尼科尔棱镜或偏振片尼尼科科尔尔棱棱镜镜 一一块块方方解解石石的的菱菱形形六六面面体体末末端端的的表表面面磨磨光光，使使镜镜角角等等于于68，将将之之对对角角切切成成两两半半，把把切切面面磨磨成成光光学学平平面面后后，再再用用加加拿拿大大树树胶胶粘粘起起来来，便便成成为为一一个个尼尼科科尔尔棱棱镜镜其其中中非非常常光光线线MP由由方方解解石石到到加加拿拿大大树树胶胶是是由由光光疏疏介介质质到到光光密密介介质质，必必将将发发生生折折射射通通过过加加拿拿大大树树胶胶，由由棱棱镜镜的的另另一一端端面面射射出出，从从而而产产生生了了平平面面偏偏振光。

振光偏振光的产生偏振光的产生尼科尔棱镜示意图尼科尔棱镜示意图偏振片偏振片 利用偏振片也能产生偏振光它是利用某些利用偏振片也能产生偏振光它是利用某些双折射晶体（如电气石）的二色性，即可选择性吸收双折射晶体（如电气石）的二色性，即可选择性吸收寻常光线，而让非常光线通过的特性，把自然光变成寻常光线，而让非常光线通过的特性，把自然光变成偏振光 分分子子结结构构中中有有不不对对称称碳碳原原子子，能能把把偏偏振振光光的的偏偏振振面面旋旋转转一一定定角角度度的的物物质质称称为为光光学学活活性性物物质质许许多多食食品品成成分分都都具具有有光光学学活活性性，如如单单糖糖、低低聚聚糖糖、淀淀粉粉以以及及大大多多数数的的氨氨基基酸酸和和羟羟酸酸等等其其中中能能把把偏偏振振光光的的振振动动平平面面向向右右旋旋转转的的，称称为为“具具有有右右旋旋性性”，以以（十十）号号表表示示；反反之之称为称为“具有左旋性具有左旋性”，以（一）号表示以（一）号表示旋光性、旋光性物质旋光性、旋光性物质旋光度旋光度 偏偏振振光光通通过过光光学学活活性性物物质质的的溶溶液液时时，其其振振动动平平面面所所旋旋转转的的角角度度叫叫做做该该物物质质溶溶液液的的旋旋光光度度，以以表表示示。

旋旋光光度度的的大大小小与与光光源源的的波波长长、温温度度、旋旋光光性性物物质质的的种种类类、溶溶液液的的浓浓度度及及液液层层的的厚厚度度有有关关对对于于特特定定的的光光学学活活性性物物质质，在在光光源源波波长长和和温温度度一一定定的的情情况况下下，其其旋旋光光度度与与溶溶液液的的浓浓度度c和液层的厚度和液层的厚度L成正比 即：即：KcL比旋光度比旋光度 当当旋旋光光性性物物质质的的浓浓度度为为 100 g/100 ml，液液层层厚厚度度为为 l dm（分分米米）时时所所测测得得的的旋旋光光度度称称为为比比旋旋光光度度，以以 表表示示 由由上式可知：上式可知： K11K 即：即： 式中：式中： 比旋光度，度；比旋光度，度； t 温度，温度， 光源波长，光源波长，nm； 旋光度，度；旋光度，度； L液层厚度或旋光管长度，液层厚度或旋光管长度，dm； c溶液浓度，溶液浓度，gml 比旋光度与光的波长及测定温度有关比旋光度与光的波长及测定温度有关通常规定用钠光通常规定用钠光D线（波长线（波长 589.3nm）在）在20时测定，在此条件下，比旋光度用时测定，在此条件下，比旋光度用 表示表示 因在一定条件下比旋光度因在一定条件下比旋光度 是已知的，是已知的，L为一定，故测得了旋光度就可计算出旋光为一定，故测得了旋光度就可计算出旋光质溶液中的浓度质溶液中的浓度c。

变旋作用变旋作用定义定义 具有光学活性的还原糖类（如葡萄糖，具有光学活性的还原糖类（如葡萄糖，果糖，乳糖、麦芽糖等），在溶解之后，其果糖，乳糖、麦芽糖等），在溶解之后，其旋光度起初迅速变化，然后渐渐变得较缓慢，旋光度起初迅速变化，然后渐渐变得较缓慢，最后达到恒定值，这种现象称为变旋作用最后达到恒定值，这种现象称为变旋作用 这这是是由由于于有有的的糖糖存存在在两两种种异异构构体体，即即型型和和型型，它它们们的的比比旋旋光光度度不不同同这这两两种种环环型型结结构构及及中中间间的的开开链链结结构构在在构构成成一一个个平平衡衡体体系系过过程程中中，即即显显示示出出变变旋旋光光作作用 变旋现象变旋现象 因此，在用旋光法测定蜂蜜，商品葡萄糖等含有因此，在用旋光法测定蜂蜜，商品葡萄糖等含有还原糖的样品时，样品配成溶液后，宜还原糖的样品时，样品配成溶液后，宜放置过夜放置过夜再测再测定若需立即测定，可将中性溶液（定若需立即测定，可将中性溶液（pH=7）加热至加热至沸沸，或加几滴，或加几滴氨水氨水后再后再稀释定容稀释定容；若溶液已经稀释定；若溶液已经稀释定容，则可加入碳酸钠干粉至石蕊试纸刚容，则可加入碳酸钠干粉至石蕊试纸刚显碱性显碱性。

在在碱碱性溶液中，变旋光作用性溶液中，变旋光作用迅速迅速，很快达到平衡但微碱，很快达到平衡但微碱性溶液不宜放置过久，温度也不可太高，以免破坏样性溶液不宜放置过久，温度也不可太高，以免破坏样品旋光仪旋光仪WXG型半荫旋光仪型半荫旋光仪检糖计检糖计WZB自动旋光仪自动旋光仪WGX型半荫旋光仪型半荫旋光仪结构和原理结构和原理 起偏棱镜一般用尼科尔（起偏棱镜一般用尼科尔（Nicol)棱镜，以棱镜，以获得偏振光获得偏振光 旋光管盛装待测液的玻璃管旋光管盛装待测液的玻璃管 检偏棱镜仍用尼科尔（检偏棱镜仍用尼科尔（Nicol)棱镜，用以棱镜，用以检测从旋光管射出的偏振光振动平面与原来相检测从旋光管射出的偏振光振动平面与原来相比较的角度（可由刻度盘上的数值读出）比较的角度（可由刻度盘上的数值读出）检糖计检糖计 检糖计专用于糖类的测定故刻度数值直检糖计专用于糖类的测定故刻度数值直接表示为蔗糖的百分含量（接表示为蔗糖的百分含量（W/V），其测定原），其测定原理与旋光计相同在结构上有以下特点理与旋光计相同在结构上有以下特点 检糖计的基本光学元件检糖计的基本光学元件自动旋光仪自动旋光仪当检测池中放进存有被测溶液的试管后，当检测池中放进存有被测溶液的试管后，由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋转由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋转了一个角度，零度视场便发生了变化，转了一个角度，零度视场便发生了变化，转动检偏镜一定角度，能再次出现亮度一致动检偏镜一定角度，能再次出现亮度一致的视场。

这个转角就是溶液的旋光度，测的视场这个转角就是溶液的旋光度，测得溶液的旋光度后，就可以求出物质的比得溶液的旋光度后，就可以求出物质的比旋度根据比旋度的大小，就能确定该物旋度根据比旋度的大小，就能确定该物质的纯度和含量了质的纯度和含量了 旋光法测定味精浓度旋光法测定味精浓度样品溶液配制样品溶液配制精确称取味精样品精确称取味精样品10.00g，加，加4050mL蒸馏水蒸馏水溶解，搅拌加入分析纯盐酸溶解，搅拌加入分析纯盐酸16mL，使味精全部，使味精全部溶解冷却至室温，蒸馏水定容至溶解冷却至室温，蒸馏水定容至100mL旋光仪调零旋光仪调零预热预热10min，放进滤光片取，放进滤光片取16mL分析纯盐酸分析纯盐酸蒸馏水定容至蒸馏水定容至100mL装满旋光管，调整零点装满旋光管，调整零点样品液测定样品液测定样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，测定旋光度，记录温度测定旋光度，记录温度 物质被辐射能照射后，分子内部获得外源能物质被辐射能照射后，分子内部获得外源能量，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，转变量，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，转变成激发态分子能级，使分子处在高能域不稳定状成激发态分子能级，使分子处在高能域不稳定状态，因此，它必须释放多余的能量，变成稳定状态，因此，它必须释放多余的能量，变成稳定状态的分子。

态的分子 分子发光分子发光：由激发态能级回到基态能级的过程：由激发态能级回到基态能级的过程中以光的形式释放多余的能量，并发射出比原波中以光的形式释放多余的能量，并发射出比原波长更长的光谱长更长的光谱 荧光分光光度法荧光分光光度法：检测分子发射光谱的分析方：检测分子发射光谱的分析方法第二节第二节 荧光检测技术荧光检测技术一、特点一、特点 专一性强专一性强灵敏度高：测定同样浓度物质的含量，通常比吸灵敏度高：测定同样浓度物质的含量，通常比吸收光谱灵敏度高收光谱灵敏度高24个数量级左右个数量级左右选择性强：既可分析发射光谱，也可分析激发光选择性强：既可分析发射光谱，也可分析激发光谱，偏振光谱谱，偏振光谱发光方式多：物理发光，化学发光，生物发光发光方式多：物理发光，化学发光，生物发光可分析参数多：可分析荧光光谱，荧光强度，荧可分析参数多：可分析荧光光谱，荧光强度，荧光效率，荧光寿命等多种物理参数光效率，荧光寿命等多种物理参数 二、方法原理二、方法原理荧光现象：荧光现象：是一种发光现象，当一种波长的是一种发光现象，当一种波长的光照射在某一荧光物质时，该物质被激发光照射在某一荧光物质时，该物质被激发, 若能在极短的时间内发射出较激发波长更长若能在极短的时间内发射出较激发波长更长波长的光波长的光, 在激发态停留的时间大约在激发态停留的时间大约10-810-4s. 发射的光谱称为发射的光谱称为荧光光谱荧光光谱.磷光光谱磷光光谱: 若这种光在激发态停留较长的时若这种光在激发态停留较长的时间间, 即在激发态停留的时间大约是即在激发态停留的时间大约是10-410s, 系统内发射出比荧光波长更长波长的光系统内发射出比荧光波长更长波长的光. 发发射的光谱称为射的光谱称为磷光光谱磷光光谱.1.荧光产生机理荧光产生机理（1）分子能级）分子能级：最低第一级电子激发态振最低第一级电子激发态振动能级动能级是产生荧光的基础。

分子吸收能是产生荧光的基础分子吸收能量后，电子跃迁到哪一个能级并不重要，量后，电子跃迁到哪一个能级并不重要，重要的是吸收了能量的分子经过内转移重要的是吸收了能量的分子经过内转移以后，将能量降到最低第一级电子激发以后，将能量降到最低第一级电子激发态振动能级后，态振动能级后，能否以光子的形式释放能否以光子的形式释放能量能量，如能就会发射荧光，否则不会。