5第五章愈伤组织培养剖析.ppt

第五章 愈伤组织的培养,第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子,第一节 愈伤组织的诱导和分化,1 愈伤组织概念 2 愈伤组织的诱导 3 影响愈伤组织诱导形成的主要因素,1 愈伤组织概念,是指植物体在自然或人工条件的诱导下，经细胞脱分化等一系列过程改变了它们原有的特性而形成的一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团称为愈伤组织(callus)2 愈伤组织的诱导,2.1 来源：依外植体不同，愈伤组织可以发生自组织（如：形成层、皮层、髓、次生韧皮部及木薄壁组织和表皮等）、器官（如子叶、叶茎段、根、幼胚等） 诱导愈伤组织成败的关键在于培养的条件，主要是激素的种类及浓度（外源激素水平）内源激素水平是指外植体的类型及其原来在植株上所处的部位2.2 培养的条件-植物激素的作用,生长素类：2,4-D、IAA和NAA等，浓度0.01～10mg·L-1， 细胞分裂素类：KT、6-BA和玉米素等，浓度0.1～10mg·L-1 生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合应用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成注：在诱导愈伤组织生长时，要注意到因植物材料不同而采用不同的植物生长物质和不同的浓度。

2.3 愈伤组织的形成,从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：,2.3.1 起始期：,细胞准备进行分裂的时期 在刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧气等)和激素（如生长系、细胞分裂素）的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸含量迅速增加, 从而诱导细胞开始分裂起始期细胞内发生的变化,气体交换增加，如氧气的吸收增加 激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成，诱导细胞开始分裂 RNA含量增加 蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%） 酶活性增强 细胞的大小仍然和外植体时一样，没有多大改变,※ 起始期的长短： 由一系列内部（植物的种类、生理状况）和外部（光照、外源激素）因素决定 例如菊芋的起始期有时还不需要1天，胡萝卜则要好几天， 而菊芋块茎贮藏时间的改变，起始期也发生改变2.3.2 分裂期:,分裂期：外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂增生子细胞的过程 脱分化：细胞由静止期进入分裂期，恢复分裂机能外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外层细胞数目增加， 细胞体积缩小，无液泡，细胞平均鲜重下降细胞的核和核仁增大到最大逐步回到分生组织状态。

细胞中RNA含量持续上升，达到最大值 随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快分裂期细胞的主要表现:,细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明1mg/l 2,4-D,10mg/l 2,4-D,分裂期愈伤组织的共同特征：,2.3.3 形成期：,形成期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞 细胞类型包括：薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等细胞分裂部位和方向发生改变：内部细胞发生分裂，形成瘤状或片状的分生组织结节，分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，也可以进一步分化形成维管组织结节，最终形成部分维管组织如管胞、纤维组织等，但不形成维管系统 细胞的体积相对稳定，不再减少 出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等 生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或 浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色形成期细胞特点：,2.4 愈伤组织的分类,易碎的愈伤,坚硬的愈伤,生根的愈伤,渗出粘性多糖的愈伤,根据愈伤质地划分为：,,,,,Red,white callus,Green callus,Yellow callus,,,,根据愈伤色泽划分为：,,,根据愈伤发生部位：,2.5 愈伤组织生长周期,外植体的细胞经过起动、分裂和形成等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。

由于原来培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡 愈伤组织生长周期为2－4周 如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地(如2～4周)将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长第一节 愈伤组织的诱导和分化,1 愈伤组织概念 2 愈伤组织的诱导 3 影响愈伤组织诱导形成的主要因素,3 影响愈伤组织诱导形成的主要因素,（1）不同植物形成愈伤组织的能力不同 ； 同一植物不同器官形成愈伤组织的能力不同； 同一植物同一器官不同生理状况的外植体形成愈伤组织的能力不同 例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难； 花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难； 幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织 脱分化比较难3 影响愈伤组织诱导形成的主要因素,（2）培养基种类对愈伤组织诱导的影响选择适当的基本培养基对愈伤的生长很重要诱导愈伤组织常用的培养基为MS和B5 （3）培养条件对愈伤组织诱导的影响: 湿度条件、温度条件、光照条件 （4）外源激素对愈伤组织诱导的影响---重要因素2,4-D和BA浓度对银胶菊茎段愈伤组织生长的影响,各种生长素对黄瓜各外植体愈伤组织诱导的效应 （各种生长素浓度为10μmol/L）,优良愈伤组织具备的特性,1）高度的胚性，易于得到再生植株 2）分散性好，易于建立优良悬浮系 3）增殖能力旺盛 4）经过长期继代培养不丧失胚性。

第五章 愈伤组织的培养,第一节 愈伤组织的诱导和分化 第二节 愈伤组织中的形态发生 第三节 人工种子,第二节 愈伤组织中的形态发生,经过起动、分裂和形成期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生 只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株1 愈伤组织形态发生方式 2 愈伤组织器官发生-形成不定芽或不定根 3 愈伤组织胚状体发生 4 愈伤组织培养的应用,1 愈伤组织形态 发生方式,在愈伤组织的不同部位分别形成根和芽,先不定芽，在茎基部长根,先长根，后长芽,通过体细胞胚胎/胚状体途径再生植株,,,,,,,1 愈伤组织形态发生方式 2 愈伤组织器官发生-形成不定芽或不定根 3 愈伤组织胚状体发生 4 愈伤组织培养的应用,芽或茎叶多发生在愈伤组织的表层，属外起源， 根原基发生在组织的深处，与整体植株发生类似，是内起源 愈伤组织的器官分化与分生细胞团有密切关系 一般从茎尖或胚诱导的愈伤组织容易分化形成器官，这可能与这些愈伤组织有顶端分生组织的分生细胞团有关， 经脱分化诱导的愈伤组织如果很少或较难形成分生细胞团，其发生器官或组织分化的难度就大。

2 愈伤组织器官发生-形成不定芽或不定根,2.1 植物激素的作用 适宜的植物激素配比在器官分化中有着重要的作用 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽生长素 细胞分裂素,,＝,激素配比模式,高：,适中：,有利于愈伤组织的形成；,有利于根的形成；,低：,有利于芽的形成愈伤分化,生长素在愈伤组织形态建成中的作用极为重要，对形成维管组织分化过程有显著影响,法国植物学家Camus（1949）将小营养芽嫁接在菊苣属植物根的愈伤组织表面，经培养一段时间后，愈伤组织已分化出维管组织 Wetmore等用洋丁香芽嫁接于愈伤组织上，在芽基部的周围发生了零星分布的分裂细胞团，稍后由进一步分化成维管组织图 在丁香的愈伤组织上嫁接一个具2个或3个叶原基的茎端 嫁接后54天愈伤组织中维管组织的诱导情况 1．苗端 2．维管束 3．愈伤组织块,证实：芽能诱导维管组织的分化是与芽在生长时合成了某些植物激素有关 生长素浓度和木质部发生之间存在着一种反比关系，低浓度的生长素能刺激木质部的发生糖跟生长素的作用洋丁香愈伤组织实验： 0.05 mg/L IAA和10 g/L蔗糖 少量木质部分子 和20 g/L蔗糖 有木质部产生 很少韧皮部 和20-35 g/L蔗糖 木质部韧皮部都有分化 和40 g/L蔗糖 只有韧皮部分化,2 愈伤组织器官发生-形成不定芽或不定根,2.1 植物激素的作用 2.2 外植体自身因素,（外源激素）,（内源激素）,2.2 外植体自身因素,在栽培或插条中容易再生的植物，其器官或组织在离体培养下也容易再生。

通常在培养中先形成不定芽者，其基部多易生根； 但有些植株完成再生苗后，生根仍较困难通常不定芽和根的形成分两步：,1）诱导不定芽：采用分化培养基（含有6-BA、KT等）使得愈伤组织形成不定芽，增加繁殖系数 2）诱导根：不定芽长大出现叶片后，将伸长的苗从基部切下转入生根培养基（含生长素IBA 、NAA）诱导生根 采用1／2MS培养基作为生根培养基，降低无机盐浓度有利于根的分化芦荟的植物组织培养过程,1 2 3 4 5,6 7 8 9,10 11,芽（丛芽、单芽）,1 愈伤组织形态发生方式 2 愈伤组织器官发生-形成不定芽或不定根 3 愈伤组织胚状体发生 4 愈伤组织培养的应用,3 愈伤组织胚状体发生,胚状体的概念 胚状体在发育早期的特征 产生方式 胚状体诱导的影响因素 胚状体再生植株 诱导胚状体途径再生植物的优点,3.1 胚状体（embryoid） ：指在植物细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚一样的细胞群。

也称为体细胞胚 经过： 原胚－球形胚－心形胚－鱼雷形胚－成熟胚,图5-5 石龙芮胚状体发生的过程 1～2. 实生苗的下胚轴表面出现的胚状体 3. 下胚轴的部分放大 4. 表皮细胞的最初启动 5～8. 产生胚状体的表面细胞启动情况 9. 球形状 10. 早期的心形胚 11～12. 已产生子叶和苗端的胚 13.下胚轴横切面示不同发育情况的胚状体,胚状体从愈伤组织外层细胞以及深部细胞起源，这些细胞形成细胞质浓厚、细胞核大的胚性细胞 团，胚性细胞 团继续分裂形成体细胞胚可可心形胚和球形胚,,香蕉心形体细胞胚,,玫瑰心形体细胞胚,至少发现43科，93属，117种植物能形成胚状体植物体细胞具有成胚的潜力,3 愈伤组织胚状体发生,胚状体的概念 胚状体在发育早期的特征 产生方式 胚状体诱导的影响因素 胚状体再生植株 诱导胚状体途径再生植物的优点,3.2 体细胞胚状体在发育早期的特征,a、具有两极性 b、胚状体的维管组织与母体植物或供体外植体的维管组织无组织解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织形成的或外植体中的维管组织相联系 c、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”形，而不定芽的维管组织无此现象。

其发生有三个特征,,,,,,,,独立的维管系统,非独立的维管系统,不定芽与胚状体的区别,3 愈伤组织胚状体发生,胚状体的概念 胚状体在发育早期的特征 产生方式 胚状体诱导的影响因素 胚状体再生植株 诱导胚状体途径再生植物的优点,3.3 胚状体的产生方式,1）直接在器官上发生 2）培养物先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化成胚状体 3）花药培养中，由小孢子发育成 4）在单细胞和原生质体培养中，由细胞先形成一个胚形细胞团，再发育成胚状体1）生长素 2）其他植物生长物质的作用 3）氨源形态的影响 4）其他培养条件对胚状体发生的影响,3.4 体细胞胚状体诱导的影响因素,3.4 体细胞胚状体诱导的影响因素,1）生长素 愈伤组织在生长素0.5～1mg·L-1的培养基上分化形成分生细胞团（称胚性细胞团）； 转移到生长素含量很低（0.01～0.1mg·L-1）或完全没有生长素的培养基上，就能发育为成熟胚 形成体细胞胚的关键是除去或降低培养基中的生长素成分（如2,4-D）。