病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
6页1、病毒感染力的滴定(TCID50 的测定)概念:半数感染量(median infective dose, ID50) 表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID50 的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量 LD50( 50% lethal dose):用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量 EID50(egg 50% infective dose):用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量 TCID50(50% tissue culture infective dose):用细胞来检测蚀斑形成单位(plaque forming unit,PFU):用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞 1 瓶2、胰酶、吸球、吸管 、生长液3、96 孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液(PRV )四、TCID 50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管 中将病毒液作连续 10 倍的稀释,从 10-1-10-10。2、将稀释好的病毒接种到 96 孔微量培养板中,每一稀释度接
2、种一纵排共 8 孔,每孔接种 100l。3、在每孔加入细胞悬液 100l,使细胞量达到 23105 个/ml 。4、设正常细胞对照,正常细胞对照作两纵排。(100l 生长液+100l 细胞悬液)5、逐日观察并记录结果,一般需要观察 5-7 天。6、结果的计算,按 Reed-Muench 两氏法或 Karber 法五、TCID 50的计算方法1、Reed-Muench 两氏法累计病毒液稀释度出现 CPE 孔数无 CPE 孔数CPE 孔数 无 CPE 孔数出现 CPE 孔所占的%10-1 8 0 27 0 100( 27/27)10-2 8 0 19 0 100( 19/19)10-3 7 1 11 1 91.6 (11/12)10-4 3 5 4 6 40(4/10)10-5 1 7 1 13 0.7(1/14)10-6 0 8 0 21 0(0/21)CPE:Cytopathic effect距离比例(高于 50%病变率的百分数-50% )/ (高于 50%病变率的百分数-低于 50%病变率的百分数)(91.6-50 )/(91.6-40) 0.8lgTCID50=距离比例 稀释度对数
3、之间的差+高于 50%病变率的稀释度的对数=0.8(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义:将该病毒稀释 103.8 接种 100l 可使 50%的细胞发生病变。2、Karber 法病毒液稀释度 出现 CPE 的孔数 出现 CPE 孔的比率10-1 8 8/8=110-2 8 8/8=110-3 7 7/8=0.87510-4 3 3/8=0.37510-5 1 1/8=0.12510-6 0 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L:最高稀释度的对数D:稀释度对数之间的差S:阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义:将该病毒稀释 103.875 接种 100l 可使 50%的细胞发生病变。实例 1 鸡新城疫活疫苗(一)培养病毒 将鸡新城疫病毒(la sota 株)接种于 911d 鸡胚的尿囊腔中,接种后 4872h 收获病毒,供检测与制苗用。(二)检测尿囊液病毒的 EID501EID50 的概念 EID50 为半数鸡胚感染量,是利用不同稀释度的病毒液接种鸡胚后,能
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