病毒感染力的滴定(TCID50的测定)
病毒感染力的滴定（TCID50 的测定）概念：半数感染量（median infective dose， ID50） 表示在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的某种动物半数感染所需最小细菌数或毒素量。一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50 的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量 LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量 EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量 TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料1、长满单层的细胞 1 瓶2、胰酶、吸球、吸管 、生长液3、96 孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV ）四、TCID 50的操作步骤1、在青霉素瓶或离心管 中将病毒液作连续 10 倍的稀释，从 10-1-10-10。2、将稀释好的病毒接种到 96 孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共 8 孔，每孔接种 100µl。3、在每孔加入细胞悬液 100µl，使细胞量达到 23×105 个/ml 。4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl 生长液+100µl 细胞悬液）5、逐日观察并记录结果，一般需要观察 5-7 天。6、结果的计算，按 Reed-Muench 两氏法或 Karber 法五、TCID 50的计算方法1、Reed-Muench 两氏法累计病毒液稀释度出现 CPE 孔数无 CPE 孔数CPE 孔数 无 CPE 孔数出现 CPE 孔所占的%10-1 8 0 27 0 100（ 27/27）10-2 8 0 19 0 100（ 19/19）10-3 7 1 11 1 91.6 （11/12）10-4 3 5 4 6 40（4/10）10-5 1 7 1 13 0.7（1/14）10-6 0 8 0 21 0（0/21）CPE：Cytopathic effect距离比例（高于 50%病变率的百分数-50% ）/ （高于 50%病变率的百分数-低于 50%病变率的百分数）（91.6-50 ）/（91.6-40） 0.8lgTCID50=距离比例× 稀释度对数之间的差+高于 50%病变率的稀释度的对数=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含义：将该病毒稀释 103.8 接种 100µl 可使 50%的细胞发生病变。2、Karber 法病毒液稀释度 出现 CPE 的孔数 出现 CPE 孔的比率10-1 8 8/8=110-2 8 8/8=110-3 7 7/8=0.87510-4 3 3/8=0.37510-5 1 1/8=0.12510-6 0 0/8=0lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数D：稀释度对数之间的差S：阳性孔比率总和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含义：将该病毒稀释 103.875 接种 100µl 可使 50%的细胞发生病变。实例 1 鸡新城疫活疫苗（一）培养病毒 将鸡新城疫病毒（la sota 株）接种于 911d 鸡胚的尿囊腔中，接种后 4872h 收获病毒，供检测与制苗用。（二）检测尿囊液病毒的 EID501EID50 的概念 EID50 为半数鸡胚感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种鸡胚后，能使半数鸡胚发生感染的病毒量。2病毒 EID50 的测定（1）稀释病毒 将收获的尿囊液充分混匀后取 1ml，作 10 倍递进稀释至 10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度。（2）接种鸡胚 每个稀释度接种 911d SPF 鸡胚 5 枚，接种量为0.1ml/枚，37温箱培养，逐日观察至 120h，其间死亡的鸡胚及时拿出冷藏，至第 5d 时将所有的鸡胚置 4冰箱中冷却 4h 或过夜，收获每枚鸡胚的尿囊液，分别存放。（3）检测血凝价，判断感染情况 用微量血凝试验逐枚检测鸡胚尿囊液中病毒的血凝价，当 HA1:128 时判为感染。3根据血凝价计算 EID50：EID50 计算举例(1)EID50 测定结果见表EID50 测定结果 (接种剂量 0.1ml)观察结果 累计结果病毒稀释度感染数 无感染数 感染% 感染数 无感染数 感染%10-5 5 0 100 10 0 10010-6 3 2 60 5 2 7110-7 2 3 40 2 5 2910-8 0 5 0 0 10 0（2）按 Reed 和 Muench 法计算 EID50EID50 的对数= 高于 50%病毒稀释度的对数距离比例×稀释系数的对数本例高于 50%感染鸡胚的病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.5，稀释系数的对数为-1。代入上式则：lg EID50=（-6）0.5× （-1 ）=-6.5 EID50=10-6.5/0.1ml即：将病毒悬液作 10-6.5 稀释后，给鸡胚接种 0.1ml，可以使 50%的鸡胚感染。(3)结果判断在生产实践中，通过 EID50 检测，当尿囊液中病毒的 EID5010-6.0 时，方可作为制苗毒液，达不到标准的毒液应弃去或浓缩处理，达到毒价标准后方可灭活制苗。实例 2 鸡传染性法氏囊炎弱毒活疫苗制备（一）培养病毒按实训五制备鸡胚成纤维细胞悬液，通过细胞计数结果，调细胞数为 100 万个/ml 。按 0.3%0.5%的量同步接种鸡传染性法氏囊弱病毒，置 37 5%CO2 培养箱培养 7296h，观察 CPE，由法氏囊炎病毒所致的 CPE 主要表现为细胞变圆、拉丝、脱落等。细胞出现70%以上的 CPE 时即可将培养瓶反复冻融 3 次，收获病毒，供检测用。（二）检测 TCID501TCID50 的概念 TCID50 为半数细胞培养物感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后，能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。2病毒 TCID50 的测定（1）稀释病毒液 将细胞培养的病毒液作 10 倍递进稀释，即稀释成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 、10-7。（2）接种细胞培养板 取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按11 混合，接种于 96 孔细胞培养板上。每个稀释度接种 46 孔，每孔 100µL，同时设立病毒对照和细胞对照组。置 37 5%CO2 培养箱培养 72h。观察记录病变情况。（3）判断 70%以上的细胞出现 CPE 判为感染。3TCID50 计算举例（1）CPE 结果见表TCID50 测定结果 (接种剂量 100µL)观察结果 累计结果病毒稀释度CPE 数 无 CPE 数 感染% CPE 数 无 CPE 数 感染%10-5 5 0 100 11 0 10010-6 4 1 80 6 1 8610-7 2 3 40 2 4 3310-8 0 5 0 0 9 0（2）计算按 Reed 和 Muench 法TCID50 的对数=高于 50%病毒稀释度的对数距离比例×稀释系数的对数本例高于 50%病毒稀释度的对数为-6，距离比例为 0.68，稀释系数的对数为-1。代入上式则：lgTCID50=（-6）0.68×（-1）=-6.64TCID50=10-6.64，100µL即：将病毒悬液作 10-6.64 稀释后，给细胞培养物接种 100µL，可以使 50%的细胞产生 CPE。（3）结果判断 当细胞培养毒液中病毒的 TCID5010-6.0 方可判为合格。
