普通生物学第四篇遗传与变异第23和24章幻灯片

1、1,第4篇 遗传与变异,2,23.1 基因工程的相关技术 23.2 基因工程主要的工具酶 23.3 基因克隆的质粒载体 23.4 重组DNA的基本步骤 23.5 基因工程的应用,21,重组DNA技术,23,3,重组DNA技术,重组DNA技术（recombinant DNA technique）： 是指将一种生物体的某个特定基因（即目的基因，其本质是通过分离纯化或人工合成的DNA分子）与载体DNA 在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（宿主细胞）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的一系列操作程序，也称为分子克隆技术、遗传工程、基因工程。,4,23.1 基因工程的相关技术,5,核酸的分子杂交,DNA的变性与复性,变性：双链分开（碱基间氢键断裂） 加热、极端pH、有机溶剂、低盐浓度 复性：双链重新缔合 退火（缓慢降温），或其它环境条件复原 杂交：不同来源的两条互补核酸序列缔合成双链,6,分子探针,探针(probe)：是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。 核酸探针：是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所

2、以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。核酸探针分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。,7,放射性标记物 常用的同位素有32P、3H、35S 非放射性标记物 应用较多的是生物素和地高辛。二者对亲和素有独特的亲和力，通过连接在亲和素上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。,探针标记物,8,核酸印迹,Southern印迹: Southern blot, 可以检测特定的DNA序列。 先用限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行变性处理，使双链DNA解离成单链，并将其转移到NC膜或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交，洗脱，曝光。,9,Southern印迹,限制性内切酶 切DNA,电泳分离,印迹转移,放射性探针杂交,胶片显影,胶片曝光,10,11,12,Northern印迹: Northern blot, 是用来分析RNA的。Northern印迹的方法与Southern印迹基本相同，可参照进行。 斑点印迹：Dot-blot，将待

3、测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。但不能鉴定所测基因的分子量。 原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。用来检测完整细胞中的核酸序列。,13,聚合酶链式反应（PCR）,PCR技术就是在体外试管中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。,加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列； （2）与目的基因两条链各自5端序列相互补 的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）； （3）TaqDNA聚合酶； （4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）。,14,PCR的基本步骤： 变性、退火、延伸三步反应：,高温变性：95oC双链DNA解链成为单链DNA。 低温退火：约55oC引物与模板的单链DNA的特定互补部位配对结合。 适温延伸：72oC以目的基因为模板，从引物的3端延伸，合成互补的新DNA链。,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍，30轮循环可获得230（1.07109)个基因片段。,15,Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意图,模板DNA的热变性：模板DNA经加

4、热至95左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,16,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,17,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。,18,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,19,20,No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16

5、 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,21,23.2 基因工程主要的工具酶,限制性内切酶 DNA连接酶 反转录酶,22,限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列特定的位点分子手术刀。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 已经发现和鉴定了200多种。 限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧，因而可形成粘性末端，另一些酶切割位点在回文序列中间，形成平头末端。,限制性内切酶,23,粘性末端,平头末端。,粘性末端,24,DNA连接酶,不同来源的DNA片段，经限制性内切酶酶切后，由DNA连接酶连接封闭。 在一条DNA链的3末端

6、具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团（-P）的情况下， DNA连接酶能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键 。 DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上的nick（切口），而不能封闭 gap（缺口）。,25,26,DNA连接酶有两种：,大肠杆菌DNA连接酶: 只能连接平齐末端，用NAD+作能源辅助因子 噬菌体T4DNA连接酶: 能连接平齐末端和粘性末端，用ATP作能源辅助因子。,27,T4 连接酶,28,平齐末端DNA片段的连接：,添加接头粘性末端 添加 poly(dA)、 poly(dT) 尾部 粘性末端,29,30,31,反转录酶又称RNA指导的DNA聚合酶。是以RNA为模板合成DNA的酶。 这种酶是1970年美国科学家特明（H.M.Temin）和巴尔的摩（D.Baltimore）分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。 主要用途是从mRNA反转录合成互补DNA（cDNA）。,反转录酶,32,23.3 基因克隆的质粒载体,33,质粒：是细菌细胞中独立于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞

7、中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。,质 粒,34,载体：是一种可以将外源DNA片段送入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，这种工具也是一个DNA分子。 克隆载体：在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并引入到宿主细胞中进行大量繁殖，使外源DNA片段得到大量扩增。 表达载体：就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使外源DNA片段能够在宿主细胞中表达蛋白质。 目前最常用的载体包括细菌质粒、l噬菌体、cosmid质粒等。,35,质粒做为克隆载体的必备条件： 具有复制起点； 携带选择标记； 具有多种限制酶切位点； 具有较小分子量和较高拷贝数； 具有安全性。,36,质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。,质粒载体pBR322,37,优点一：相对分子质量较小。质粒载体pBR322的大小为4361bp, 优点二：它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。 优点三：

8、具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记。 优点四：具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,38,Features of plasmid pBR322,39,Restriction map,40,1该质粒比较小，可以插入一段较长的DNA片段。 2进入宿主细菌细胞后，pUC18在每个细胞中可复制形成大约500个拷贝。 3在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点,细菌质粒pUC18,41,23.4 重组DNA的基本步骤,42,重组DNA操作一般步骤：,（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细 胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获 得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,43,获得目的基因常用的方法： 直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因； 以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片

9、段； 利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段； 人工合成DNA 。,44,目的基因的获取,克隆载体的构建,外源基因与载体的连接 （体外重组）,重组DNA导入受体菌,转化子的筛选和鉴定,克隆基因的表达,45,以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆,46,23.5 基因工程的应用,47,1986年美国把烟草花叶病毒的外壳蛋白基因转移到番茄体内，它们可对致命的病毒产生抗性，培育出抗烟草花叶病毒的番茄植株。,抗病毒植株：,48,将苏云金杆菌的杀虫蛋白基因转入植物细胞后，当害虫在这种转基因植株上取食后会使其致命。,例如：将杀虫蛋白基因转入棉花后已获得了抗虫棉花。据估计，棉花杀虫剂每年耗资645亿美元，抗虫棉花的育成将对减少杀虫剂的用量、保护环境有巨大的作用。 这是全球第一个被批准商业化的转基因植物。,抗虫害植株：,49,将一种蛋白基因转入大豆植株，大豆即获得有抗阿特拉津除草剂的能力。,抗除草剂植株：,50,抗盐碱、抗干旱、抗冻害、抗环境污染等抗逆性基因的转化。,抗环境因子的植株：,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,51,改良品质的植株：,转基因生菜含铁量高,美国新型转基因巨型大南瓜,52,真正的转基因蓝玫瑰，不是用染料染上去的（日本）,提高其经济价值或观赏价值,Transgenic petunia (with extra purple gene) 矮牵牛,53,转珊瑚虫红色基因的斑马鱼,水母荧光蛋白基因,54,55,把大鼠生长因子基因转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。,56,乙肝疫苗原先必须以乙肝患者的血液作原料，通过精细提取，才能取得。 科学家们将乙肝病毒基因中生产抗原的部分切割下来，然后跟其他质粒进行重组，再引入到大肠杆菌DNA的合适位置上。通过培养，大肠杆菌十分顺利地产生了人们所需要的乙肝疫苗。,利用基因工程菌生产药物,57,生长激素是一种由脑垂体分泌的微量的化学物质。幼年时生长激素分泌过少引起侏儒症。 过去，人们常用尸体上切下的脑垂体提取生长激素，因而产量很低。 现在，将人生长素基因转入大肠杆菌，可生产人生长激素。每升菌液可得到人生长激素2.4毫克。发酵罐的容量可达700升。,58,这种莴苣制得的

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