精编制作免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用PPT课件
121页1、第十三章免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用 河南科技大学第一附属医院检验科许德英 第十三章免疫细胞的分离与免疫细胞功能检测及应用 第一节免疫细胞的分离一 外周血单个核细胞分离二 淋巴细胞的分离三 T细胞和B细胞的分离四 T细胞亚群的分离 第二节淋巴细胞标志及亚群分类一 细胞表面标志及亚群二 B细胞表面标志三 NK细胞表面标志第三节抗原提成细胞表面标志的检测一 单核 吞噬细胞系统二 树突状细胞第四节淋巴细胞的功能检测一 T细胞功能检测二 B细胞功能检测 三 NK细胞活性测定第五节其他免疫细胞功能检测技术一 中性粒细胞功能检测二 巨噬细胞功能检测第六节免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用 思考题小结 第一节免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离淋巴细胞的分离T细胞和B细胞的分离T细胞亚群的分离 一 外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞 peripheralmononuclearcells PMNC 包括淋巴细胞和单核细胞 monocyte Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞 是一种单次差速密度梯度离心的分离法 细胞分离基本原理 不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同
2、不同细胞表面分化抗原不同 不同细胞密度不同 人的红细胞密度为1 093粒细胞密度为1 092单个核细胞 淋巴细胞和单核细胞 的密度为1 075 1 090 不同细胞密度不同 用1 077 0 001的分层液可将细胞分离 分离液的基本要求 对细胞无毒 基本等渗 不溶于血浆或分离物质 有一定密度 密度梯度离心法 densitygradientcentrifudation Ficoll 商品名 成份 2份6 聚蔗糖 ficoll 水溶液 1份34 泛影葡胺 hypaque 生理盐水溶液 最常用的方法 分离纯度可达95 细胞获取率80 试验尽量在低温下进行 4 8 或冰浴 密度梯度离心 Ficoll 离心 密度梯度分离单个核细胞 Ficoll分层液 密度梯度分离单个核细胞 Ficoll分层液 二 淋巴细胞分离 贴壁粘附法吸附柱过滤法磁铁吸引法Percoll分离液法 连续密度梯度离心 去单核细胞 贴壁黏附法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中 移至37 温箱静置1h左右 单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上 而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞 继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群
3、 因B细胞也有贴壁现象 用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失 2 吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中 凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中 从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞 此法简单易行 对细胞极少损害 3 Percoll分层液法 Percoll 商品名 经过聚乙烯吡咯烷酮 polyvinylpyrolidone PVP 处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液 高速离心后 形成连续密度梯度 可将密度不同的细胞分离纯化 分离淋巴细胞纯度达98 单个核细胞纯度达78 流程长 烦琐 费用高 密度梯度分离单个核细胞 Percoll分层液 E花环沉降法尼龙毛柱分离法 三 T细胞和B细胞的分离 E花环分离法 T细胞 CD2 LFA2 E受体 绵羊红细胞SRBC E花环 比重增加 Ficoll Hypaque分离液分离 低渗 尼龙棉柱分离法 尼龙棉装入5ml注射器中 加入淋巴细胞悬液 37 5 CO2 1 2h RPMI1640完全培养基灌洗 洗脱液中为T细胞 原理B细胞可粘附尼龙毛 T细胞不具有粘附活性 方法评价 实验室常用分离方法之一简便
4、 易行获得细胞纯度较高T细胞90 B细胞80 尼龙毛柱法 E花环法 T细胞可达99 以上 四 T细胞亚群的分离 亲和板结合分离法磁性微球分离法荧光激活细胞分离仪分离法 亲和板分离法 利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群 其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性 将相应抗体结合于塑料平板上 继加细胞悬液 凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合 抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取 同样若用特异性抗原交联在塑料板上 则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞 淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触 可引起细胞激活 因此 凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时 本法更适用 如要分离CD4 或CD8 细胞 则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附 用抗Ig抗体则可分离B细胞 同样 用活化的C3包被 可分离出有C3受体的细胞 荧光激活细胞分离仪分离法 五 免疫磁珠法 原理 将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 Immunomagneticbead IMB 加入细胞悬液 IMB上的Ab与细胞表面的Ag反应 形成抗体 抗原的复合物 外加磁场 分选出结合有免疫细胞的IMB 直接法 磁珠大小可以选择 大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 免疫
5、磁珠法细胞分选过程 免疫磁珠细胞分选装置 全自动细胞分选系统 流式细胞分析仪 细胞分选 细胞分选 cellsorting 有选择地从一个混合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术 488nmlaser FluorescenceActivatedCellSorting ChargedPlates Singlecellssortedintotesttubes FALSSensor Fluorescencedetector 第二节淋巴细胞标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原 Clusterofdifferentiation CD 细胞表面分化抗原 CD抗原 适用于T B细胞的分离已知CD抗原细胞亚群的分离未知CD抗原细胞亚群的分离 阴性分选 一 T细胞表面标志及其亚群 CD3 CD4 CD8 辅助性T细胞 helpTcell Th CD3 CD4 CD8 细胞毒性T细胞 cytotoxicTcell TcorCTL CD4 CD25 调节性T细胞 regulatoryTcell TrorTreg 二 B细胞表面标志 SmIg Fc受体 补体受体 EB病毒受体 部分CD分
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