液相色谱培训课程

石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国HPLC培训教程培训教程 1石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国六、六、液相色谱的方法开发（一）分离方法2石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国第一步干什么?z想办法得到各种信息y向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法y查文献，如CA(化学文摘)y仪器制造商的文献，如Watersz对色谱柱有足够的了解y掌握分离机理，自己开发方法z充分了解您自己的样品3石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国分析时要了解哪方面的情况？z灵敏度的要求有多高?z样品的本底是否很复杂?z有多少组份要分析?z对分析的精确度、准确度等有多高要求?z是否因是日常检验，而要求方法容易使用?4石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国分离时要了解哪方面的情况？z要分离（即制备）的样品量有多大?z要分离的组份在样品中的含量很高?还是微量?z是否需要保持生物活性?z对分离产物纯度的要求有多高?z纯度或活性的鉴定如何完成?5石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国一般的具体步骤z先用一根短的色谱柱z用相对较高的流速z使用尽可能纯度高的标准品z先用高强度的洗脱液z调节k 值改变保留值z调节值改变选择性z调节柱长度改变柱效及分离速度6石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国使用文献方法z色谱柱填料的种类、品牌是否相同?z注意文献方法的流动相y是否损害色谱柱?y如色谱填料品牌不同，需要调整流动相z注意色谱柱的规格：内径、柱长y需要调整流速、进样量z注意梯度条件z了解系统的滞后体积（梯度）7石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国色谱方法转换z如果没有与文献或要求相近的色谱柱y转换进样量y转换流速8石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国反相色谱的方法开发z开发过程实例y色谱条件x色谱柱：C18，4.6mm25cmx流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱x流速：1ml/miny样品：对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben)对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben)对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)9石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国改变容量因子 K谱图10石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国改变选择性az通过改变流动相改变选择性y同样强度的不同溶剂z改变色谱柱11石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国离子型化合物的分离方式z使用离子交换柱离子交换法y主要用于“强”阴、阳离子z使用反相柱y离子抑制色谱法x通过改变流动相的pH值，使样品成中性y离子对色谱法x加入“对离子”，使样品呈中性12石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国离子抑制色谱z离子型化合物在反相色谱柱上不保留z改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离z适用于弱酸性化合物的分离y降低流动相的pH值，使样品降低离子化y使用硅胶基质C18填料z使用条件应在填料基质的范围内y硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内13石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国常用缓冲液及其pH值14石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国离子抑制色谱实例z在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。15石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国离子抑制色谱的使用范围如果：一些酸在pH低于2时还保持离子化一些碱在pH高于7时还保持离子化z可以有以下的选择y离子交换色谱y使用聚合物反相柱，在pH高于7时用离子抑制法y使用“离子对色谱法”16石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国在高pH值下用离子抑制色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温流动相：乙腈/0.01M NH4OH+0.01M TBA流 速：1.0ml/min检 测：UV-240nm样 品：巴比妥的衍生物 巴比妥 己琐巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥17石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国离子对色谱法z在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂y与样品中可电离的组份形成“对离子”y在反相色谱柱上分离离子型化合物z离子对试剂的类型yPIC A：磷酸季丁铵，适用于弱酸yPIC B：烷基磺酸盐，适用于弱碱x烷基长度不同，形成对离子的能力不同x通常有：B5，B6，B7，B8yPIC D4：磷酸二丁胺，适用于弱碱18石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国离子对色谱机理19石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国用离子对？还是离子抑制？20石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国 抗组胺及减充血剂药物的分析离子对色谱的应用21石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国使用五烷基磺酸盐Packing:Bondapak C18Column:4 mm ID x 30cmSolvent:Methanol/H2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Acid&1%HOAc(50/50)Flow Rate:2.0 ml/minDetector:UV,254 nm,0.1 AUFS1.Maleic Acid2.Phenylephrine3.Phenylpropanol-amine4.Naphazoline5.Phenacetin6.Pyrilamine 22石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国使用六烷基磺酸盐Packing:Bondapak C18Column:4 mm ID x 30cmSolvent:Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Acid&1%HOAc(50/50)Flow Rate:2.0 ml/minDetector:UV,254 nm,0.1 AUFS1.Maleic Acid2.Phenylephrine-HCl 3.Phenylpropanolamine-HCl 4.Naphazoline-HCl 5.Phenacetin6.Pyrilamine Maleate23石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国使用七烷基磺酸盐1.Maleic Acid2.Phenylephrine3.Phenylpropanolamine4.Naphazoline5.Phenacetin6.Pyrilamine Packing:Bondapak C18Column:4 mm ID x 30cmSolvent:Methanol/Water with 0.005M HEPTANE Sulfonic Acid&1%HOAc(50/50)Flow Rate:2.0 ml/minDetector:UV,254 nm,0.1 AUFS24石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国样品浓度对分析的影响25石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国离子对色谱分析水溶性维生素26石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国用不同的离子对试剂27石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国方法开发的其他因素z流速对柱效的影响y不同内径的色谱柱有自己的最佳流速z样品的进样量(浓度)对柱效的影响z样品的进样体积对柱效的影响z溶剂粘度对柱效的影响以上因素均影响分离度28石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国开发液相色谱方法z分辨率是色谱分离中主要考虑的因素z在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下几个因素都要考虑。y灵敏度y载样量y分析速度y溶剂损耗.成本.容易使用.色谱柱寿命.效率29石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国结论z充分用已知样品结构确定以哪种方法开始y普通反相?离子抑制?离子对?还是其他z观察流动相条件改变时色谱峰的移动y根据变化的方向及大小决定下一步干什么z改变参数时要合理，每次只改动其中一个变量！z色谱柱的改变影响最大30石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国六液相色谱的方法开发（二）梯度方法31石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国梯度方法y梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。32石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国梯度洗脱的特点z优点y单位时间的分离能力增加y检测灵敏度提高z缺点y仪器设备要求高y不适合某些检测方式y柱需再生y定量分析的重复性较低33石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国梯度的洗脱方式z高压梯度及低压梯度34石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国梯度洗脱的可变参数zA及B液的成分和化学特性z梯度的陡度z梯度的变化形状35石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国如不用梯度：分离不理想36石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为 中中 国国梯度条件的优化37石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司 做做 好好 药药 为为