ω-3多不饱和脂肪酸对急性肝功能衰竭小鼠肝细胞保护机制研究
10页1、 -3多不饱和脂肪酸对急性肝功能衰竭小鼠肝细胞保护机制研究 张玉荣,李高峰,汤 彦,章美元(复旦大学附属中山医院青浦分院急诊科,上海 201700)目前,脓毒症是一种致命性器官功能障碍综合征,感染是引发脓毒症的源头,是临床急危重患者常见病死原因之一。临床脓毒症患者往往存在高分解代谢和免疫紊乱,而机体免疫功能紊乱参与了脓毒症相关性肝损伤甚至急性肝衰竭的发生与发展过程,即使有效抗生素能够及时清除病原体,也需要免疫调节使促炎和抗炎恢复平衡,减少细胞因子风暴导致多器官功能障碍综合征(MODS)发生,故免疫调节治疗成为研究热点1。目前,-3 多不饱和脂肪酸在脓毒症中治疗效应已得到越来越多的关注,但治疗效果不一致,还存在许多不确定问题2-3。因此,有必要进一步研究-3 多不饱和脂肪酸对脓毒症相关性的急性肝衰竭是否存在抗炎、修复等保护作用。1 材料与方法1.1 实验动物与分组选取BLAB/C 小鼠100 只,雌雄各半,均68周龄,体质量(212.6)g,由扬州大学比较医学中心提供许可证号:SCXK(苏)2021-0009。遵循有关实验动物管理和使用的规定,本研究经复旦大学附属中山医院青浦分院批准(E
2、C-C-015-A01-V03)。空白组8 只,造模后随机分成4 组:模型组 20 只,乌司他丁组 24 只,3-PUFA 组24 只,促肝细胞生长素组24 只。各组在造模和干预治疗后6、12、24 h 时间点留取标本。动物6 只,笼饲养,自由饮水和饮食。1.2 动物模型制备和干预治疗措施小鼠自由饲养1 周,禁食1 天,自由饮水,先予以D-氨基半乳糖800 mgkg-1(南京市生物有限公司)加脂多糖(8 mgkg-1,批号:I4319,sigma)腹腔注射造模,随后2 h 予以乌司他丁(0.5万kg-1,国药准字:H19990134)腹腔注射,3-PUFA(0.2 gkg-1,国药准字:J20100092)加无菌注射10% 糖水稀释后尾部静脉注射,促肝细胞生长素(20 mgkg-1,国药准字:H20046249)腹腔注射。1.3 血清标本采集和相关检测按照干预后时间点6、12、24 h 采集标本,留取静脉血,3 000 rmin-1,离心10 min 后,分离出血清放置-70冰箱存放,统一检测。采取ELISA检测血清降钙素原(PCT)、肿瘤坏死因子(TNF-)、白介素6(IL-6)、谷
3、丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和胆碱酯酶(CHE),严格按照说明书操作。1.4 肝组织标本采集采集血清标本后,留取肝组织(生理盐水冲洗后),肝组织放置预先留有2%甲醛溶液的标本瓶,用于做病理HE 染色观察,另为无菌干燥瓶,分别放入组织标本,统一称质量1 g,然后加入0.9%生理盐水2 mL,制作组织均浆,4 000 rmin-1离心10 min 后,留取上清液1 mL,在 miRBase 上查寻目的基因序列,由美国Invitrogen 公司设计合成引物,提取上清液中miRNAs,合成cDNA。以U6 作为内参,在9700 型基因扩增仪中扩增 miRNAs。RT-PCR反应条件:95预变性10 min,95变性10s,60退火60 s,共37 个循环。采用2-CT(Livak)法计算肝组织microRNA-122a 的相对表达量。1.5 统计学方法采用SPSS 20.0 软件进行数据分析处理,TN F-、IL-6 、PCT、ALT、AST、CHE、microRNA-122a 水平等计量资料以均数标准差(s)表示,组间、组内结果比较采用t检验,以P0.05 表示差异有统计学意义。
4、2 结果2.1 各组小鼠变化比较空白组小鼠表现正常饮食活跃,造模后2 h 内各组累计死亡18 只:模型组6 只,乌司他丁组4 只,3-PUFA 组5 只,促肝细胞生长素组3 只。造模后各组存活小鼠表现为体毛松散,活动明显减少,进食量少;乌司他丁组、3-PUFA 组和促肝细胞生长素组均表现为卷曲明显,活动减少,能够勉强自由采食和饮水。2.2 各组小鼠血清ALT、AST 与CHE 比较造模后6 h 后小鼠血清ALT 与AST 水平升高,CHE 水平明显下降,且模型组与空白组的ALT、AST和CHE 水平比较,差异具有统计学意义;3-PUFA 组、乌司他丁组、促肝细胞生长素组的ALT、AST 和CHE水平比模型组明显下降,且2 组比较,差异有统计学意义;3-PUFA 组与乌司他丁组的ALT、AST 和CHE水平比较,差异无统计学意义;3-PUFA 组与促肝细胞生长素组的ALT、AST 比较,差异有统计学意义,CHE 水平差异无统计学意义。见表1。表1 各组小鼠治疗后的血清ALT、AST 与CHE 比较( s ) UL-1表1 各组小鼠治疗后的血清ALT、AST 与CHE 比较( s ) UL
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