病理技术在医学科研中的应用

1、病理技术在医学科研中的应用病理学科是一门基础与临床之间起着桥梁作用的重要学科,病理研究方法在技术工作上又是多方面的 ,有尸体解剖,大体标本的制作,制片（石腊切片,冰冻切片,半薄切片,超薄切片等）,组织化学方法,免疫酶标技术,荧光技术,摄影技术等.作为实验技术人员大量的工作是病理制片技术, 即常规病理切片,特殊染色,以供教学,科研,临床活检诊断之用 .第一章病理技术的应用范围帮助临床查明死因（原因不明的死亡）手术后病变标本,以明确诊断（临床活检）提供教学,科研的资料第一节 组织制片的概述组织制片技术的应用 ,从 1665年由 HOOk 发现细胞开始 ,已有 300多年的历史.最早应用冰冻切片 ; 随后又进一步利用石蜡的硬度,以石蜡包埋组织,制成石腊切片;后来又利用明胶,火棉胶 ,碳蜡和塑料等物质的韧性,以其包埋组织而制作切片.组织制片技术随着生物学和医学的发展而发展.切片染色方法可以显示不同细胞和组织形态, 以及细胞和组织中某些化学成分含量的变化.因此 ,组织制片技术是教学,医学和科研中不可缺少的一个组成部分.第二节 制片的种类1,组织切片法任何组织切片必须依靠切片机将组织切成薄片（厚度

2、以小山计），再进行染色而得到结果.在切成薄片以前必须设法使组织内部渗入足够的支持物质,使组织保持一定的硬度,然后使用切片机进行切片.渗透到组织中的支持剂（物质）有多种,如石腊,明胶,火棉胶和塑料等.冰冻组织切片法是直接利用快速冷冻法进行切片 .2,组织非切片法不用切片机,不经过切片手续而制成组织切片的方法,包括整体封藏法,浮片法 ,压碎法和组织直接印片法.这些方法操作简单而快,可根据制片的需要进行选择使用.第三节 制片方法的程序组织切片法制作过程中的各种操作1,取材与固定取材是根据实验的目的和要求及病变程度而合理取得组织材料.固定是用化学药品把组织原来的结构保存下来,以便观察研究之用 , 固定剂同时具有硬化细胞组织的作用 ,使制片便于进行 .2,洗涤与脱水洗涤是把渗入组织中的固定剂洗去,防止染色中的结晶产生.脱水是驱除组织中的水分,以利于透明和浸蜡 .3,透明与浸蜡（透蜡）脱水后的组织中水分已被透明可代替,而有利于浸蜡.浸蜡的目的是使组织有一定的硬度而有利于切片和细胞组织保持一定的生活时状态.4,包埋与切片用石蜡和其他包埋剂将组织包绕一定的形状以便于切片 .将包埋好的组织块用切片机切成

3、一定的厚度（以小山计）.5,贴片（展片,捞片）和染色将已切妥的切片在温水中展平整后用载玻片贴上,稍晾赶后再烤片.染色可使细胞和组织被染上不同的颜色而产生一定的折射率,便于显微镜观察.6,封 片切片染色后用胶类物质将其封固,以利于长期保存.二 , 组织切片的主要程序1 .标本切开或取厚块-组织固定一固定后处理一（石腊切片法）脱水一透明-浸蜡一包埋一 切片一粘片一脱蜡-各级乙醇-水洗-常规染色或特殊染色-脱水-透明一树胶封片2 .标本切开或取厚块一组织固定（冰冻切片法）-冰冻切片-粘片一乙醇固定及水洗一常规 染色一脱水-透明一树胶封片.第二章固定 ,固定液和取材第一节 组织固定方法在制作组织切片的过程中 ,首先将组织充分固定后才能进行制片 ,尤其对石蜡切片 ,这是不可少的重要步骤 .1,固定的意义就是使要观察的组织构造尽量接近于它生前的正常状态.2,组织固定的目的1） 迅速防止组织 , 细胞的死后变化,防止自溶与腐败,以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似 .2）使细胞内的蛋白质,脂肪,糖 ,酶等各种成分转变成不溶性物质,以保持它原有的结构与生活时相仿 .3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起

4、来,而产生不同的折射率,造成光学上的差异, 以便染色后易于鉴别和观察.4） 固定剂兼有硬化作用 ,使组织硬化增加组织硬义,便于制片.5） 防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构 .6）经过固定的组织,能对染料产生不同的亲和力而着色清晰,便于辩认.由于固定的目的是在于尽量使组织和细胞保持与生活时相仿的成分和形态.因此 , 固定的组织愈新鲜愈好, 固定组织时 ,应使用足量的固定液,其固定液的量一般不少于组织块总体积的 4 倍以上 .3,固定剂的性质为了能够达到固定的目的 ,必须具备以下的性质:1） 迅速渗入组织而固定原生质,使短期解剖的组织形态不至于有较大变化 .2） 固定液有相当的渗透力,对组织各部分的渗透力相等,可使组织内外完全固定.3）使组织细胞中不至于因固定引起人为的改变.4）在凝固原生质以后,增加细胞对于各种穿透的抵抗力 ,不至于因以后的处理而使固定后的原生质变形.5）尽可能避免使组织膨胀或收缩 .6）能使细胞内的成分（蛋白质） 凝固或沉淀下来.7）增加细胞内含物的折光程度,易于鉴别.增加媒染作用和染色能力.8）使组织变硬,适于制片,但又不使材料太坚硬而松脆 .9）使组织充分

5、固定,便于保存.第二节 介绍几种常见固定液固定剂有简单固定剂（液）和混合固定剂两类.作为较好的固定液,首先有强渗透力 ,能迅速地渗入组织内部 ;其次不会使组织过渡收缩或膨胀,并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质;最后能使组织达到一定硬度,获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的亲和力 .一 ,简单（单纯） 固定液1,甲醛 （Formeldehyde）甲醛（福尔马林）为一种无色气体,溶于水成为甲醛水溶液, 甲醛是一种还原剂,极易挥发旦有强烈刺激性气味.在平时常用的甲醛浓度为10%,这是指以10ml 甲醛加入 90ml 的水配成的 ,此液实际上只有4%的甲醛.甲醛水溶液渗透力强 , 固定均匀 ,对组织收缩较少 .但经乙醇脱水时收缩很大,它能使组织硬化并增加组织的弹性. 固定厚度适当的组织,较为适宜. 因早醛为非沉淀性固定剂,它不能使白蛋的及抗蛋白沉淀;但可与蛋白质化合,对脂肪,神经,及髓鞘的固定很好,也可固定高尔基体,线粒体 ,又是复糖的保存剂,使肝糖元变为微细的颗粒团.使用甲醛固定的陈旧组织,以多血的赃器如脾,肝等 ,较易发生黑色或棕黑色的沉淀,称甲醛色素 .2,乙醇 (Ethyl

6、 alcohol)乙醇为无色液体,可以水在任何比例下混合.它是一种还原剂,很易被氧化为乙醛,在变为醋酸,所以不能与铬酸,重铬酸钾,锇酸等氧化剂混合.用于固定时以 80% 95%的浓度为好,它具有固定硬化脱水等多种作用.高浓度乙醇固定的组织硬化显著,组织在高浓度乙醇中留置过久,易变脆 ,也使组织收缩明显 ,均可缩小原组织体积的 20%.因 70%乙醇可较久的保存组织.另外 ,乙醇其渗透力较弱,能沉淀白蛋白,球蛋白和核蛋白.因此,乙醇除固定作用外,还具有硬化和脱水作用 ,所以它在制片过程中用途很大.3,醋酸 (Acetic acid)醋酸又名乙酸,是带有刺激味的无色液体,因在室温15时常结成冰状 冰醋酸 .特性 :(1)在 15时成冰状结晶,有刺激性味,可溶水 ,乙醇一般配成5%作为混合固定液.(2)醋酸只能沉淀核蛋白,对染色质, 固定较好 ,对白蛋白,球蛋白,固定不佳.对脂肪,糖元不能固定.(3)醋酸能使组织膨胀,因此 ,可抵偿因乙醇,升汞 ,甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化,故常配成混合固定液.(4)醋酸穿透速度最快,米粒大的组织在单纯醋酸固定液中 1 2h 即可.5%醋酸的pH 值在

7、2弋戏匕时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变性.4,氯化汞 (Mercury bichloride)氯化汞俗称升汞.为白色粉末或针状结晶,有剧毒,必须严格保管及注意使用 .通常用其饱和水溶液,在室温的水中饱和度为5%7%.特性 :（1）能沉淀蛋白质,它不能固定脂肪,类脂和糖类.（2）穿透力较弱 ,单独使用可使组织收缩.因此,多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混合固定液组织宜薄而小 2 3 毫米,固定6 18h.（3）升汞混合液固定的组织对于细胞的结构,特别是核的细微结构,显示由为清晰.（4）经升汞固定的组织易产生汞盐的沉着 （为棕黑色结晶 ）易损害切片刀 ,因此染色前必须脱汞.5,苦味酸 （Picric acid）苦味酸是一种黄色结晶 , 是一种相当强的酸. 它在水中的溶解度随室温而变化 , 约在0.91.2%,在空气中能自燃,在密闭器中能剧裂爆炸.为使用安全起见,常制成饱和水溶液贮藏保存 .特性 :1）能沉淀蛋白质,但对脂肪和类脂无固定作用.2）穿透力很慢,细胞收缩显著,但不会使组织硬化 .3）有软化皮肤的作用,配制的Bouin 氏液对头皮及全身皮肤制片效果甚好 .4）苦味酸固定的组

8、织,固定时间太久会影响HE 染色 （苦味酸对碱性染料不易着色）.5）苦味酸酒精饱和液为糖元较好的沉淀剂.6,丙酮丙酮又名醋酮或本酮,极易挥发,易燃的无色液体,能与水,醇,氯仿,醚及多种溶液混合.特性 :1）它可以作固定剂,又可作脱水剂 ,穿透速度快,可使蛋白质沉淀凝固,2毫米以下的组织固定半小时至 1 小时即可 .2）可引起组织较强的收缩使之变硬,对核固定不佳.3）对某些酶的固定很好,如碱性磷酸酶,酸性磷酸酶等.4）丙酮一般多与氯化汞,甲醛混合液使用,先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化 .7,重铬酸钾1）为橙红色结晶,有毒 ,是强氧化剂 ,不能与酒精等还原剂混合,常配成0.5%水溶液固定组织.2）重铬酸钾单独固定组织不能沉淀蛋白质,但加入冰醋酸转变为铬酸,（即酸化重铬酸钾）,可使蛋白质凝固沉淀.3）重络酸钾与甲醛混合（临用时配过久失效）为未酸化的重铬酸钾固定剂,是固定线粒体,高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂 ,若配成 Eenker 氏液 ,能很好的固定细胞质,胞核及染色体 .4）重铬酸钾穿透速度快,固定组织收缩很小,但经酒精脱水时都有明显收缩.经重络酸钾固定的组

9、织必须流水充分洗涤（612h）,否则影响染色.5）经重铬酸钾固定的组织 ,对酸性染料,如伊红染色良好,但对碱性料染,如苏木素较差,若加入升汞及醋酸等,则对细胞核染色极佳.以上叙述了几种单纯固定液的性质和用途,它们各有其优缺点,但单独使用的不多 ,而混合固定液的应用更为广泛.单独固定液如重铬酸钾等单独应用效果不好 ,若与其他固定剂混合就可以成为优良的固定液.二,介绍几种常用的混合固定液1,乙醇 甲醛液 （AF 液）配制:95%或无水乙醇90ml加入40%并装甲醛10ml为常用固定液，取材后立即入此固定液. 此液兼有脱水作用，用于固定肥大细胞和糖元较好，米粒大小固定46h,大块组织1224h, 固定后不经水洗,直接放入95%酒精开始脱水.2,AAF 液配制：纯酒精85ml+醋酸5ml+甲醛10ml3,Zenker 氏液配制:重铭酸钾2.5g+升汞5g+蒸储水100ml加温溶解，冷却过滤，贮于棕色瓶内，成为贮存液.用时取此液临 95ml 再加入冰醋酸5ml 即成 .Zenker 氏液为组织学 ,细胞学,病理学常用的固定液,多用于固定一般组织,能使细胞核和细胞浆染色较为清晰，固定时间1224h然后冲洗24h,切片脱腊后需脱汞（浸入5%碘酒精10）,脱碘（5%硫代硫酸钠）一流水洗.4,Bouin 氏液配制苦味酸饱和液75ml+甲醛25ml+冰醋酸5ml此液渗透快,组织收缩小,固定均匀,此液为常用固定液.它对肝,皮肤 ,胰脏特染效果好,但此液固定过久对碱性染料的着

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