药监系统官方培训06细菌内毒素方法介绍-蔡彤

细菌内毒素检查法及干热法除热原验证标准品简介中国食品药品检定研究院化药所 药理室蔡 彤2019.4中国食品药品检定研究院National Institutes r Food and Drug Control中国食品药品检定研究院简 介凝胶法及光度测定法干热法除热原及验证标准品实验涉及内容及相关要求National Institutes for Food and Drug Control简 介 细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分之一：LPS 在细National Institutes for Food and Drug Control简 介脂多糖（LPS）直径约1-50nm 平均分子量60000 脂多糖组成：类脂A核心多糖特异性多糖链类脂A：表现生物活性。核心多糖：连接类脂 与特异性多糖链，由恒定的多糖组成。特性多糖链：因菌种不同而不同 3-5个多糖重复排列，决定特异性。又称o-特异性链。National Institutes for Food and Drug Control简 介 细菌内毒素具有：u耐热性 不易灭活（180、2小时；250、30分钟）uu分子极性 易聚集、吸附，需充分混合高致热性 作用于人体，引起发热、寒颤、恶心、甚至死亡等热原反应National Institutes for Food and Drug Control热原与细菌内毒素的关系 热原：所有能引起热原反应的物质称为热原。细菌内毒素只是热原的一种。不是每一种热原都具有脂多糖结构，但是所有已知的内毒素都具有热原活性。细菌内毒素热原National Institutes for Food and Drug Control热原与细菌内毒素的关系 在GMP条件下进行药品生产和质量控制，可以接受的观点是：不存在内毒素意味着不存在热原。理解为：在GMP的生产条件下，细菌内毒素是热原物质的质控关键点。National Institutes for Food and Drug Control简 介 细菌内毒素检查法检 验 注射用药品（内毒素）防止发生 临床热原反应 安全性试验National Institutes for Food and Drug Control内毒素检查法的建立与完善发现（50年代）：1956年Johns Hophins 大学动物学家Frederik.Bang发现革兰阴性细菌的粗提取物（LPS）能使鲎的血细胞凝聚。建立（60年代）：1968年.Levin和Bang用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种 反应，并创立鲎试验（细菌内毒素检查法前身）National Institutes fo细菌内毒素检查法的创始人National Institutes for Food and Drug ControlDrs.Frederick B.Bang and J k Levin内毒素检查法的建立与完善 阐明机制（70年代）：70年代后期多位学者从分子水平阐明参与鲎血细胞凝聚机制。补充完善（80年代）：1981年日本学者Iwanaga发现鲎试剂中的G因子可以被真菌、酵母和藻类细胞壁中的一类细菌多糖(1,3)-D-葡聚糖激活。而LPS则不能激活G因子旁路。National Institutes for Food and Drug Control反应原理内毒素（旁路反应）二价离子pH6.08.0-葡聚糖鲎试剂美国内毒素检查法发展 1973年 FDA发表通告声明鲎试剂为生物制品，限于药品中间过程检验。1980年 FDA宣布可以检测人或兽用注射药品成品的内毒素并进入药典，但没有在药典正文中收载品种 1983年 药典中规定5种大输液40种放药开始使用内毒素法同时5种大输液删除了相应的家兔热原试验部分 1983年后品种逐 增加National Institutes for Food and Drug Control在英国、欧洲、日本的发展欧洲药典英国药典1987年收载1989年增补版收载方法 没有品种1990年注射用水1992年发布指导原则 用于检查注射用水1990年后品种逐渐增加1992年后品种逐渐增加日本药局方1991年正式收入药局方 品种只有注射用水National Institutes for Food and Drug Control1991年后品种逐渐增加细菌内毒素检查法在我国的发展历史 1975年 开始研究 1979年 第一批内毒素标准品 1988年 卫生部颁布检查法 1993年 中国药典1990年版第二增补本 收载检查法 1995年 中国药典1995年版 收录注射用水等5种注射用药品 2000年 中国药典中品种逐渐增加至69种 2005年 中国药典 中有205种 2010年 中国药典中有506种National Institutes for Food and Drug Control 2015年 中国药典中有65内毒素检查法世界范围内统一（国际化）标准物质统一 细菌内毒素检查法的统一National Institutes for Food and Drug Control国际标准物质的统一以效价作为单位1980年完成重量到效价的转变ng EU1982年美国药典开始采用效价单位EUEndotoxin Unit（EU）内毒素单位National Institutes for Food and Drug Control国际标准物质的统一 美国 Endotoxin Unit（EU）内毒素单位 WHO International Unit（IU）国际单位 WHO建立内毒素国际标准品1985年第一批国际标准品 0.7IU=1.0EU1995年第二批国际 准品 1.0IU=1.0EU2013年第三批国际标准品 1.0IU=1.0EUNational Institutes for Food and Drug Control内毒素检查法的统一（国际化）方法的统一：从2001年1月起美国药典(USP)欧洲药典(EP)日本药局方(JP)开始执行统一的细菌内毒素检查法（BET）法。即“细菌 毒素检查法国际协调方案（ICH Q4B 14）”。中国药典自200 年版起同世界接轨 中国药典20 0年版和2015年版内毒素检查法也与协调案保持一致National Institutes for Food and Drug Control细菌内毒素检查方法的分类 细菌内毒素检查方法包括：浊度法 动态浊度法限度实验光度测定法终点浊度法凝胶（定量实验)半定量实验显色基质法 动态显色法终点显色法 可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。National Institutes for Food and Drug Control细菌内毒素检查凝胶法凝胶法p 凝胶法系利用细菌内毒素与鲎试剂反应可形成凝胶的原理，来测定供试品中的内毒素含量是否符合规定。National Institutes for Food and Drug Control反应原理内毒素（旁路反应）二价离子pH6.08.0-葡聚糖鲎试剂凝胶法 主要操作：将 供试品溶液0.1ml+鲎试剂0.1ml在管中混匀，37+1 下反应60+2min。如果供试品溶液中所含的内毒素鲎试剂的灵敏度就会形成坚实凝胶。灵敏度：所 鲎试剂能够检测的最低内毒素浓度。National Institutes for Food and Drug Control凝胶法 缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者 坚实凝胶 阳性“+”National Institutes for Food and Drug Control凝胶法 未形成凝胶 凝胶不坚实、变形、从管壁滑脱者 阴性“”National Institutes for Food and Drug Control假阴性、假阳性供试品溶液假阴性（抑制干扰）鲎试剂干扰作用毒内素假阳性（增强干扰）National Institutes for Food and Drug Control干扰作用 大部分的干扰作用都可以通过使用细菌内毒素检查用水稀释供试品的方法排除。当有些干扰作用仅使用稀释法不能排除时，可采用其他方法消除干扰因素，然后再进行试验。National Institutes for Food and Drug Control干扰作用常见干扰因素及排除方法干扰因素干扰作用类型 排除方法供试品溶液本身为强酸、强 抑制 将供试品的pH值调节碱，本身具有偏酸偏碱的缓冲作用至6.08.0含有螯合剂（如EDTA）抑制 添加适当Ca2+、Mg2+含有某些抗凝因子抑制 将供试品适当加热，使抗凝因子失活含葡聚糖类物质增强 使用抗增液或特异性鲎试剂National Institutes for Food and Drug Control凝胶法有3个部分新鲎试剂在使用前 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验要对其灵敏度进行复核 检 查 法：限度试验半定量试验National Institutes for Food and Drug Control凝胶法 鲎试剂灵敏度复核新品种在建立细菌内毒素检查法时需使用干扰试验进行方法学研究，以验证样品是否对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰作用，确定在何条件下不再存在干扰作用，可得到准确可靠的检验结果。干扰实验：预实验（SOP）正式 检 查 法：限度试验半定量试验trol凝胶法 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验 检 查 法：限度试验半定量试验日常检验National Institutes for Food and Drug Control凝胶法 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验 检 查 法：限度试验半定量试验National Institutes for Food and Drug Control凝胶法 鲎试剂灵敏度复核 干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验 检 查 法：限度试验半定量试验National Institutes for Food and Drug Control凝胶法 鲎试剂灵敏度复核National Institutes for Food and Drug Control鲎试剂灵敏度复核试验实验操作:取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物 用 口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合1 分钟。然后进行稀，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0、1.0、0.5、0.25（为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每 混合30秒National Institutes for Food and Drug Control鲎试剂灵敏度复核试验内毒素浓度 2 0.5 0.25 阴性对照鲎试剂平行管u加样时，每管标准溶液需再混合10秒 加样后，将混合液轻轻混匀371保温60分钟2分钟National Institutes for Food and Drug Control鲎试剂灵敏度复核试验反应终点浓度内毒素浓度 2 0.5 0.25 阴性对照+试剂+平行管+试验有效National Institutes for Food and Drug Control鲎试剂灵敏度复核试验反应终点浓度内毒素浓度 2 0.5 0.25 阴性对照+试剂+平行管+0.5 0.5 c=lg-1（(lg+lg+lg0.5+lg0.5)/4)=0.707 ug Control鲎试剂灵敏度复核试验 当c在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查。以标示 敏度为该批鲎试剂的灵敏度。National Institutes for Food and Drug Control鲎试剂灵敏度复核试验灵敏度复核试验的用途：不仅可考察鲎试剂灵敏度是否准确 可用于实验人员、条件、环境等的验证National Institutes for Food and Drug Control鲎试剂灵敏度复核试验 可使用鲎试剂国家参考品或日常使用的鲎试