第九章 新型生物制药技术
35页1、 新型生物制药技术苟兴华第一节 核酸药物及其制药技术q 反义核酸(Antisense nucleic acid)和核酶 (Ribozyme)q RNA干扰 (RNAi)药物q 核酸药物的修饰和给药q DNA疫苗 (DNA vaccine)技术反义核酸反义RNA分子 : 可以和目标基因的mRNA互补的 一段寡聚核苷酸分子,它影响mRNA正常功能; 反义DNA分子: 类似于反义RNA分子,可以抑制基 因表达的分子;RNA-DNA嵌合分子:经化学修饰的寡聚核苷酸类似物:Oligo 反义核酸作用机理与前体RNA结合干扰RNA剪切和成熟 与mRNA结合,封闭核糖体结合位点,影响翻译与mRNA形成dsRNA,诱导RNase H对其降解与互补DNA结合,形成DNA-RNA复合物,影响DNA复制特点q 双链RNA(如siRNA )作用强烈;q 与核酶连接作用更强。核酶(Ribozyme) 核酶不是普通的蛋白质酶,而是一类具催化活性的核酸分子,1980年Cech在嗜热四膜虫中首先发现。目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种1. 发卡状核酶2. 锤头状核酶3. 型内含子核酶4. RNaseP核酶5.
2、 丁型肝炎病毒核酶天然锤头状核酶示意图GGACA UGGCCUCCUGUCACCGGA35UUUGUUGCUGAUGAGUCCAAGCAGGUUAG底物位点催化活性位点反义核苷酸药物的应用 反义核酸技术在实验室中取得了较好的效果,90年代以来国外一些制药公司开展了若干反义药物的临床实验。 1997年,美国Genta公司研制了针对Bcl2基因的反义药物,用于治疗前列腺癌和其他恶性肿瘤。 美国Hybridon公司研制了针对巨细胞病毒(CMV)感染的反义药物并进行了临床实验。RNA干扰药物 RNA干扰(RNA interference,RNAi) 是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程 ,其广泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。 RNAi的作用原理 双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段: 启动阶段 执行阶段 RNAi的作用原理 启动阶段 当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时,细胞中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA,并将其降解成21-23bp长的小干扰RNA(siRNA),单链siRNA与一些蛋白形成复合体,构成“RNA诱导的沉默小体
3、” (RNA-induced silencing complex,RISC) 执行阶段 当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时, RISC就会切割目标RNA,并由细胞中的核酸酶将其进一步降解,从而抑制目标基因的表达启动阶段原理图启动阶段RISCRISC前体Dicer (21-23bp)siRNA执行阶段原理图执行阶段核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNAsiRNA药物 长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素,干扰素又会抑制细胞的蛋白质合成,造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小双链RNA即siRNA,则不会诱导干扰素反应,却能在细胞中激活RISC,发挥抑制基因表达的作用。 siRNA的作用 体外实验和动物模型研究证明siRNA药物可以成功抑制HIV、乙肝病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒等的感染。 siRNA还可以治疗一些非感染性疾病:美国正在开发一种治疗老年性黄斑变性的siRNA药物siRNA药物优点与缺点 优点:与反义RNA相似,siRNA作为药物具有目标基因专
4、一 性强 与反义RNA相比,siRNA药物的作用机制更加明确, 效果更加肯定 缺点:siRNA的作用需要与目标RNA间发生完全的配对,因 此对于目标RNA的突变很敏感。个别位点的突变会使 效果大打折扣 在用于抗病毒治疗时,病毒可能出现抗药突变株siRNA的设计和制备siRNA的制备 实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链反义链混合双链RNADicer酶加工Dicer酶加工siRNA构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达
5、质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录Dicer酶加工siRNADicer酶加工siRNADicer酶加工siRNA实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒正义链体外转录实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒混合反义链正义链体外转录实验室制法:构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法:构建目标基因两
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