第九章 新型生物制药技术
新型生物制药技术苟兴华第一节 核酸药物及其制药技术q 反义核酸（Antisense nucleic acid)和核酶 (Ribozyme)q RNA干扰 (RNAi)药物q 核酸药物的修饰和给药q DNA疫苗 (DNA vaccine)技术反义核酸反义RNA分子 ： 可以和目标基因的mRNA互补的 一段寡聚核苷酸分子，它影响mRNA正常功能； 反义DNA分子： 类似于反义RNA分子，可以抑制基 因表达的分子；RNA-DNA嵌合分子：经化学修饰的寡聚核苷酸类似物：Oligo 反义核酸作用机理与前体RNA结合干扰RNA剪切和成熟 与mRNA结合，封闭核糖体结合位点，影响翻译与mRNA形成dsRNA，诱导RNase H对其降解与互补DNA结合，形成DNA-RNA复合物，影响DNA复制特点q 双链RNA（如siRNA ）作用强烈；q 与核酶连接作用更强。核酶（Ribozyme) 核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具催化活性的核酸分子,1980年Cech在嗜热四膜虫中首先发现。目前已知具有催化功能的RNA结构可以分为5种1. 发卡状核酶2. 锤头状核酶3. 型内含子核酶4. RNaseP核酶5. 丁型肝炎病毒核酶天然锤头状核酶示意图GGACA UGGCCUCCUGUCACCGGA35UUUGUUGCUGAUGAGUCCAAGCAGGUUAG底物位点催化活性位点反义核苷酸药物的应用 反义核酸技术在实验室中取得了较好的效果，90年代以来国外一些制药公司开展了若干反义药物的临床实验。 1997年，美国Genta公司研制了针对Bcl2基因的反义药物，用于治疗前列腺癌和其他恶性肿瘤。 美国Hybridon公司研制了针对巨细胞病毒（CMV）感染的反义药物并进行了临床实验。RNA干扰药物 RNA干扰（RNA interference，RNAi） 是一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默的过程 ，其广泛存在于从植物、无脊椎动物到哺乳动物的各种生物。 RNAi的作用原理 双链RNA诱导诱导RNAi的过程主要分为两个阶段： 启动阶段 执行阶段 RNAi的作用原理 启动阶段 当细胞中由于感染等原因出现双链RNA分子时，细胞中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成21-23bp长的小干扰RNA（siRNA），单链siRNA与一些蛋白形成复合体，构成“RNA诱导的沉默小体” （RNA-induced silencing complex，RISC） 执行阶段 当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时， RISC就会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因的表达启动阶段原理图启动阶段RISCRISC前体Dicer （21-23bp）siRNA执行阶段原理图执行阶段核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNA核酸酶切割胞内其它AAAAAAA切割RISCAAAAAAAmRNAsiRNA药物 长链的RNA会诱导细胞合成并分泌干扰素，干扰素又会抑制细胞的蛋白质合成，造成一定的副作用。如果直接用21-23bp的小双链RNA即siRNA，则不会诱导干扰素反应，却能在细胞中激活RISC，发挥抑制基因表达的作用。 siRNA的作用 体外实验和动物模型研究证明siRNA药物可以成功抑制HIV、乙肝病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、口蹄疫病毒等的感染。 siRNA还可以治疗一些非感染性疾病：美国正在开发一种治疗老年性黄斑变性的siRNA药物siRNA药物优点与缺点 优点：与反义RNA相似，siRNA作为药物具有目标基因专一 性强 与反义RNA相比，siRNA药物的作用机制更加明确， 效果更加肯定 缺点：siRNA的作用需要与目标RNA间发生完全的配对，因 此对于目标RNA的突变很敏感。个别位点的突变会使 效果大打折扣 在用于抗病毒治疗时，病毒可能出现抗药突变株siRNA的设计和制备siRNA的制备 实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链反义链混合双链RNADicer酶加工Dicer酶加工siRNA构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录反义链正义链构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录Dicer酶加工siRNADicer酶加工siRNADicer酶加工siRNA实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒Dicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒siRNADicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒siRNA的设计和制备 siRNA的设计 应选取对于疾病发生具有至关重要作用，而对细胞的其他功能影响不大的保守基因作为目标基因，再根据目标基因的序列设计siRNA Tom Tuschl根据实验提出了一个设计siRNA的原则： 选择转译起始密码子后50-100碱基的范围，以AA作为正义链的第1，2个核苷酸，GC比为50 左右，同时在正义链和反义链的3-都有TT两个核苷酸的突变siRNA的设计和制备 siRNA的制备siRNADicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒siRNADicer酶加工双链RNA混合反义链正义链体外转录实验室制法：构建目标基因两侧分别带有噬菌体T7、SP6等启动子的表达质粒大规模的化学合成方法： 可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性大规模的化学合成方法： 可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性大规模的化学合成方法： 可以在合成时加入保护基团增加siRNA的稳定性核酸药物的修饰和给药 人体内存在大量的核酸酶，在体内应用反义RNA，siRNA等新型核酸药物治疗时，一个关键问题就是保证它们能够抵抗核酸酶的降解并被有效地运输到靶细胞。RNA的化学修饰是一个有效的途径修饰磷酸二酯键修饰核酸修饰骨架化学修饰修饰骨架化学修饰修饰核酸修饰骨架化学修饰修饰磷酸二酯键修饰核酸修饰骨架邓子新Nature Chemical Biology 2007. 核酸药物的修饰和给药 增强核酸药物有效运送到靶组织的方式： 用脂质体等材料包埋核酸药物静脉注射。如果在脂质体上加入有助于膜融合的分子如氯喹，可以进一步提高它们进入细胞的效率 在核酸分子上连接一段可以进入细胞的肽段即转导肽 不同的应用目的应采用不同的给药方式：局部注射、静脉注射，有报道表明核酸药物还可以通过皮肤给药DNA疫苗 不同于传统的蛋白质疫苗，DNA疫苗是通过基因重组技术把编码抗原蛋白的基因序列克隆到质粒，并在基因的上游加上细胞可以识别的启动子，形成一个表达载体。将这个表达载体DNA直接导入宿主细胞，由细胞的基因转录、转译系统直接合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，达到防病治病目的DNA疫苗原理DNA疫苗较传统蛋白疫苗的优点v构建生产方便，适合作为快速反应的疫苗v免疫原经过适当的加工，优于基因工程生产的抗原蛋白v可引起体液免疫和细胞免疫双重效果 DNA疫苗的表达载体进入细胞并由细胞产生蛋白，产生的蛋白一方面作为一种外源蛋白，被细胞识别并由并由型主要组织相容性复合体呈递到细胞表面诱导体液免疫;另一方面蛋白被分泌到胞外诱导B细胞产生相应的抗体4. 安全性好 第二节 基因治疗技术基因治疗的关键是将正确的基因导入人体基因导入的方式有两种方式：离体基因导入和体内基因导入患者移植细胞扩增基因修正的细胞筛选目标组织细胞基因转入基因载体载体离体基因导入方式： 治疗基因患者注射或其他方法载体扩增基因载体载体体内导入方式： 治疗基因基因治疗的方法q非生物法导入基因 常用的方法是用脂质体包裹DNA分 子，此外也将基因连接到一些高分子材料上q生物法导入基因 生物法导入基因主要利用病毒作为基因 载体将基因导入目标细胞，但近年也有利用细胞内寄生 菌进行基因导入的实验研究 常用的病毒载体有： 腺病毒 腺相关病毒 反转录病毒 基因治疗的现状与挑战q基因治疗在短短的20年里取得了很大的进步，确定了一批可以用基因治疗手段治疗的疾病，在动物模型等方面取得了良好的效果，同时已经有许多治疗方案进入临床试验q但在快速发展过程中也出现了一些问题。特别是1999年美国宾州大学在进行鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症的基因治疗期临床试验时，一名18岁的患者接受高剂量腺病毒载体治疗后不幸死亡的案例，以及2002年末在法国接受腺苷脱氨酶导入治疗严重复合免疫缺陷征的两名患病儿童次年发生了由反转录病毒载体引发的白血病的案例。因此各国对基因治疗采取了更加慎重的态度，制订了更加严格的研究规范肿瘤的基因治疗 肿瘤的基因治疗与遗传病的基因治疗不同，不强调基因长期表达和持续发挥作用，而是要求快速杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长和转移。因此对肿瘤基因载体的要求也就不同，不强调基因整合，而是强调通过基因治疗调动多种途径杀伤肿瘤细胞。这些途径包括： 1. 通过治疗基因抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡 2. 选用在肿瘤细胞可复制的病毒载体，通过病毒感染 杀伤肿瘤细胞 3. 通过诱导免疫系统识别并杀伤肿瘤细胞 4. 通过病毒载体表达药物前体的转化酶基因第三节 基于细胞的治疗技术一、免疫细胞治疗技术二、基于干细胞的治疗技术免疫细胞治疗技术q 细胞免疫在疾病预防治疗中的关键作用q 基于T细胞的免疫治疗q 基于天然杀伤细胞的免疫治疗q 基于树突状细胞的免疫治疗作用细胞免疫在疾病预防治疗中的关键作用 免疫细胞类型繁多，主要有T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核吞 噬细胞、树突状细胞、天然杀伤细胞、颗粒细胞等 在免疫功能正常的个体中，免疫细胞保持高度的活性，但由 于病原体感染或肿瘤细胞的一些特性，会形成免疫逃逸、耐受等现象。此时可以通过人为激活免疫细胞的方法来加强对特定目标的识别，起到治疗疾病作用 目前作为治疗手段的免疫细胞主要有：NK细胞、T细胞、树突状细胞基于T细胞的免疫治疗 T细胞根据功能分为辅助性T细胞（TH细胞）和细胞毒性T细胞（TC细胞） TH细胞表面带有分子标记CD4，能识别抗原，分泌多种淋巴因子，其功能是调节免疫系统增强免疫能力。 TC是效应T细胞，表面带有分子标记CD8，在抗原刺激下大量增值，并与靶细胞结合发挥杀伤靶细胞的功能。 在一些病毒感染中
