2021年theth高效液相PPT课件.ppt

凝胶色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布；它具有其他液相色谱所没有的特点：(1) 保留时间是分子尺寸的函数，有可能供应分子结构的某些信息; (2) 保留时间短，谱峰窄，易检测，可接受灵敏度较低的检测器;(3) 固定相与分子间作用力极弱，趋于零；由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长;（4）不能辨论分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必需大于10才能得以分别；1. 1分别原理分子筛效应一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动；大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快；小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，仍可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流杰出谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最终流出，这种现象叫分子筛效应；2.分子筛是人造沸石或硅铝酸盐，具有严密而整齐的孔径网状晶体结构，它的网状多孔结构使得其具有较高的吸附容量，而且具有分子选择吸附的性能，通常用于吸附气体；3.具有多孔的凝胶就是分子筛；各种分子筛的孔隙大小分布有确定范畴，有最大极限和最小极限；分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情形叫全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分别成效；直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙；假如两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分别成效；因此，确定的分子筛有它确定的使用范畴；4.综上所述，在凝胶色谱中会有三种情形：一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分；大，中，小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分别范畴之外的分子，在不转变凝胶种类的情形下是很难分别的；5.对于分子大小不同，但同属于凝胶分别范畴内的各种分子，在凝胶床中的分布情形是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入孔径较小但分布较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长；于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分别；另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小；分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，依据分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应；6.以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分别的一种液相色谱分别模式；样品分子与固定相之间不存在相互作用力（吸附，支配和离子交换等），因而凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱，空间排阻色谱，分子筛色谱等；比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，快速流杰出谱柱，不能被分别；比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，于是在固定相中停留（保留）的时间也就越长；7.8.2.固定相 化学惰性的多孔性材料，一般可分为软性，半刚性和刚性凝胶三类；凝胶指含有大量液体（一般是水）的松软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体；9.（1）软性凝胶 如葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的很多倍；它们适用以水溶性溶剂作流淌相，一般用于小分子质量物质的分析，不相宜用在高效液相色谱中；10.（2）半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶；常以有机溶剂作流淌相；用于高效液相色谱时，流速不宜大；11.（3）刚性凝胶 如多孔硅胶，多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流淌相，可在较高压强和较高流速下操作；一般把握压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否就将影响凝胶孔径，造成不良分别；12.3流淌相在凝胶色谱中，流淌相的作用不是为了把握分别，而是为了溶解样品或减小流淌相粘度；凝胶色谱所选用的流淌相必需能溶解样品，并必需与凝胶本身特殊相像，这样才能润湿凝胶；当接受软性凝胶时，溶剂也必需能溶胀凝胶；另外，溶剂的粘度要小，由于高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分别成效；这对于具有低扩散系数的大分子物质分别，尤需留意；选择溶剂仍必需与检定器相匹配；13.常用的流淌相有四氢呋喃，甲苯，氯仿，二甲基酸胺和水等；以水溶液为流淌相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流淌相的凝胶色谱适用于非水溶性样品；14.（二）色谱柱的重要参数柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积；在色谱柱中布满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示；外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示；内水体积：由于凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示； 不包括固体支持物的体积（Vg）；15. 峰洗脱体积：是指被分别物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve 表示；当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽视不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve； 当样品体积与洗脱体积比较不能忽视时，洗脱体积运算可以从样品体积的一半到峰顶位置；当样品很大时，洗脱体积运算可以从应用样品开头到洗脱峰上升的弯曲点（或半高处）； 16.二，凝胶的种类及性质 （一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍；例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克；交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200；因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范畴；Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分别不溶于水的物质； 17.（二）琼脂糖凝胶商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等；琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来疼惜网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度；一般情形下，它的结构是稳固的，可以在很多条件下使用（如水，pH4-9范畴内的盐溶液）；琼脂糖凝胶在40以上开头融解，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理； 18.（三）聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，把握交联剂的用量可制成各种型号的凝胶；交联剂越多，孔隙越小；聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度；（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分别分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性自然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜； 19.三，试验技术（一）层析柱 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管；层析柱的直径大小不影响分别度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上；此外， 直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大；分别度取决于柱高，为分别不同组分，凝胶柱床必需有相宜的高度，分别度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形堵塞，一般不超过1米；20.分族分别时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:110:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍； 分级分别时柱高与直径之线为20:1100:1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米；层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，假如支掌滤板下的死体积大，被分别组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，显现拖尾出象，降低分辩力；在精确分别时，死体积不能超过总床体积的1/1000； 21.（二）凝胶的选择 依据所需凝胶体积，估量所需干胶的量； 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量为20，1 克Sephadex G200吸水后形成的凝胶体积约40ml；凝胶的粒度也可影响层析分别成效；粒度细胞分别成效好，但阻力大，流速慢；一般试验室分别蛋白质接受100-200号筛目的的Sephadex G-200成效好， 脱盐用Sephadex G-25，G-50，用粗粒，短柱，流速快；22.（三）凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀；为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐步升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成；特殊是在使用软胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成；这种方法不但节约时间，而且仍可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气； 23.（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去；样品的粘度不行大，含蛋白为超过4，粘度高影响分别成效；上柱样品液的体积依据凝胶床体积的分别要求确定；分别蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4（一般约0.5-2ml），进行分族分别时样品液可为凝胶床的10，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30； 分级分别样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好；24.（五）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中特殊重要，常用的抑菌剂有:叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20时约为40；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会转变蛋白质和碳水化合物的层析我特性；叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质；可乐酮Cl3C-C(OH)(CH3)2在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02；在微酸性溶液中它的杀菌成效正确，在强碱性溶液中或温度高于60时易引起分解而失效；25.乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01；在微酸性溶液中最为有效；重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌成效；苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01；在微碱性溶液中抑成效正确，长时间放置时可与卤素，硝酸根离子作用而产生沉淀；仍原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用；26.凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC）： 以水或缓冲溶液作流淌相的凝胶色谱法；主要适合于水溶性高分子的分别；凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）： 以有机溶剂作流淌相的凝胶色谱法；主要适合于脂溶性高分子的分别；如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定；27.分别类型的选择 1依据相对分子质量选择 相对分子质量特殊低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱；标准液相色谱类型（液一固，液一液，及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范畴是20O2000；对于相对分子质量大于2000的样品，就用凝胶色谱法为正确； 28.2依据溶解度选择弄清样品在水，异辛烷，苯，四氯化碳，异丙醇中的溶解度是很有用的；假如样品可溶于水并属于能离解物质，以接受离子交换色谱为佳；。