植物基因工程技术及应用

1、 基因工程（genetic engineering） 基因工程（gene engineering），又称为重组DNA 技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水 平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物 质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组 DNA,然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组 合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进 行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创 造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代 。 基因工程的基本特点:分子水平操作，细胞水平 表达。基因工程的概念在这个过程中：1.“基因剪刀” 限制性核酸内切酶2.“缝纫针” DNA连接酶 3.“交通工具”载体4.“乘客”目的基因植物基因工程技术及应用植物基因工程技术及应用一、植物基因工程的发展历程1983 年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜 1994 年 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市 1995 年 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产2000 年 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆到2005年为止， 世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行

2、商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃二、植物基因工程中常用遗传 转化的基因元件 1、目的基因 真菌和细菌： GUS、HPT、NPT、GNA均来自大肠杆菌； 杀虫蛋白基因cry1Ab、cry1Ac、cry2A则来自苏云金芽孢杆菌； 抗除草剂基因Bar来自吸水链霉菌。 病毒： 几丁质酶基因。 植物： 蛋白酶抑制基因、凝集素基因等、Xa21、C4相关基因 、水稻中生产胡萝卜素前维生素A的基因。 动物： 来自水母的绿色荧光蛋白基因（GFP）、蝎的昆虫毒 素基因、蜘蛛毒素基因。 人工合成基因： Wx的反义基因。 2、选择标记基因 新霉素磷酸转移酶基因NptII：表达产物 可以拮抗卡那霉素 、G418 潮霉素磷酸转移酶Hpt基因：表达产物可 以抗潮霉素（Hygromycin B） Bar 基因：表达产物可以抗 PPT)三、转基因的主要方法及原 理植植 物物 基基 因因 转转 化化 系系 统统受体细胞转化方法转化原理载体转化系统名称共感染法 （整体接种法）Ti质粒R

3、i质粒农杆菌原生质体共培养法 （细胞接种法）RNA 载体转化系统叶盘法DNA病毒基因枪法各种受体微针注射法电击法电泳法物理原理原生质体超声波法激光法直接转化系统脂质体法PEG法化学原理浸泡法卵细胞花粉管通道法花粉粒生殖细胞细胞细胞转化法茎尖细胞种质细胞种质转化系统植物成功应用的转化方法： 直接转化法：是通过物理或化学方法将外源基因导 入植物细胞或原生质体，由此获得转基因植株的方 法。基因枪法、花粉管通道法、电击法、PEG法、 超声波法、激光束法、脂质体法和减压渗透法等。 间接转化法：是通过生物体（如农杆菌、细菌球 、病毒等）介导，将外源基因导入植物细胞。根癌 农杆菌介导转化法。基因枪法（微弹轰击法） 基本原理：将DNA包被在微小的金粉或钨 粉粒表面上，以火药爆炸、高压气体或高 压放电等作为驱动力，将微粒射入受体细 胞或组织，伴随伴随而入的DNA分子便随 机整合到寄主细胞的基因组中，从而实现 转化的目的。 优点： （1）直接将DNA送入完整的、可再生的植物细胞，避 开了原生质体分离和再生的困难。 （2）靶细胞类型广泛，不受组织类型限制，几乎所 有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用基因枪

4、进 行轰击转化。 （3）利用基因枪法可以同时将多个基因导入植物。 缺点： 易引起多拷贝插入和非孟德尔遗传，且外源DNA整合 机理不清楚，随机性较大，目标基因与筛选标记基因 有时发生重排，有益基因有可能丢失。此外，不同的 受体类型，其基因枪转化参数需进行优化，且价格昂 贵。高压气体基因枪高压气体基因枪PDS-PDS- 1000/He1000/He气 压 表 气体加速管可裂圆片运动中的微弹靶细胞PEG 诱导法 基本原理： PEG法借助化合物聚乙二醇、磷 酸钙，在高pH值条件下诱导原生质体摄取外 源DNA分子。 优点： 对细胞伤害小，转化顺利 实验成本低 受体植物不受种类限制 能够转化较大的外源DNA片段（甚至某物种的总DNA） 转化子易于筛选 结果较为稳定、重复性较好 易于推广等优点 缺点： 受体制备和保持比较困难 分化效率低，费工费时， 基因依赖性强，原生质体再生困难 再生植株结实率低，易产生突变体电击（激）法 基本原理：利用高压电脉冲作用，在原生质 体质膜上电击穿孔，形成瞬间可修复通道（ 一般只有8nm），当外源DNA附着于细胞质 膜电击点时，DNA分子就有可能通过小孔进 入细胞内，进

5、而整合到受体细胞基因组上。 优点： 除具有PEG原生质体转化法的优点外，还 具有操作简便、DNA转化效率高的优点。 缺点： 造成原生质体的损伤，使植板率降低 仪器比较昂贵。 “电注射”法，它可以直接在带壁的植物 组织和细胞上打孔，将外源基因直接导 入细胞。使用该技术可以不制备原生质 体，提高了植物细胞的存活率，而且简 便易行，现已有水稻上成功应用的报道 。 花粉管通道法 基本原理：是利用植物受粉后一定时间内 ，外源DNA可通过花粉管渗入，经珠孔通 道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的 卵、合子或早期胚胎细胞，进而借助天然 的种胚系统（Germ line）形成转基因种胚 。 优点： 在理论上可以应用于任何开花植物，不需离体再生 过程 具有广泛的应用性，特别是对于一些其它转化条件 不具备的实验室尤其值得尝试 操作简便 缺点： 无法提供令人信服的分子证据以及遗传分析数据 重复性也比较差 脂质体转化法 基本原理：是用脂类化学物质包被DNA 成球体，通过植物原生质体的吞噬或融 合作用把脂体内的DNA转入受体细胞。 激光微束介导法 基本原理：激光经光学显微镜聚焦后， 形成微米级的微光束，细胞经过这

6、种微 光束照射后，在细胞膜上可形成能自我 愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外 源DNA流入细胞，实现基因的转移。低能离子束介导法 基本原理：利用低能离子束的溅射，引 起植物细胞壁刻蚀变薄并产生局部穿孔 ，使外源DNA导入受体细胞。根癌农杆菌介导转化法 根癌农杆菌：能够诱发冠瘿瘤的称为根 癌农杆菌。 发根农杆菌：诱导毛发状根的称为发根 农杆菌。农杆菌转化原理农杆菌转化原理农杆菌与植物细胞的化学分子内共生关系农杆菌与植物细胞的化学分子内共生关系转转 录录转译转译生长素和细生长素和细 胞分裂素胞分裂素刺激细胞分裂刺激细胞分裂冠瘿碱冠瘿碱冠瘿碱分冠瘿碱分 泌泌分解分解OpinesOpines作为碳源和氮作为碳源和氮 源源ChChr rA.tA.t染色染色 体体其它其它VirVir 基因的诱基因的诱 导物导物激活激活T-DNAT-DNA加加 工工VirVir基因超量诱基因超量诱 导导TiTi质质 粒粒T-T- DNADNAVIRVIRTRTR AOAO CCCC接合转移接合转移附附 着着植物细胞植物细胞农杆农杆 菌菌损伤细胞产生的诱导物损伤细胞产生的诱导物 （酚、糖类）（酚、糖类）常用植物转基因

7、转化方法特点比较常用植物转基因转化方法特点比较评评价条件植物基因转转化方法农农杆菌法PEG法电击电击 法微针针注射法基因枪枪法花粉管通道法受体材料完整细细胞原生质质体原生质质体原生质质体完整细细胞卵细细胞宿主范围围有无无无无有性繁殖植物组织组织 培养条件简单简单复杂杂复杂杂复杂杂简单简单无转转基因植株转转化率10-210-110-510-410-510-410-310-210-310-210-1101出现现嵌合体比例有无无无多无操作复杂杂性简单简单简单简单复杂杂复杂杂复杂杂简单简单设备设备 要求便宜便宜昂贵贵昂贵贵昂贵贵便宜转转化工作效率高低低低高低单单子叶植物的应应用少可行可行可行广泛广泛1、 利用转基因植物生产功能蛋白和工 业原料利用植物生物反应器生产医用蛋白利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂利用植物生物反应器生产工业原料四、植物基因工程的应用转基因植物作为生物反应器的优势如下：植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也不高绝大多数植物的表达产物对人和牲畜无毒副作用，安全可靠植物具有完整的真核表达修饰系统，利用转基因植物生产的重组蛋白药物和疫苗在分子结构和生物活性上，与

8、人体来源的蛋白质相似利用植物生物反应器生产医用蛋白借助于根瘤农杆菌介导的转化系统，将小鼠抗体的轻链和重链编码基因分别置于两种烟草植物体内表达，然后两种重组植物品系进行杂交，产生的子代植物能同时合成小鼠的轻链和重链两种多肽。转基因烟草表达小鼠抗体转基因烟草表达小鼠抗体疫苗苹果基因工程疫苗苹果基因工程利用植物生物反应器生产医用蛋白人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）是治疗高歇斯症遗传病的特效药，可能也称得上当今世界最昂贵的药物。每生产一个剂量的hGC要消耗 2000-8000 只人类胎盘，因此这种药物一直供不应求。美国VPI研究机构的专家将克隆的hGC基因经改造导入到烟草中，并获得高效表达。在每克这种转基因烟草的新鲜叶片中，hGC的含量竟高达1mg，也就是说，从一株转基因烟草中就能产生出传统工艺需要消耗数千只胎盘才能获得的药物。转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶 利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂荷兰科学家把果糖基转移酶基因导入烟草和马铃 薯中，在获得的转基因植株中，果聚糖含量占8%（干重）以上，具有良好的开发前景。转基因烟草和马铃薯生产果聚糖利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂荷兰科学家从黑曲霉

9、菌中克隆到植酸酶基因，并将之导入到烟草的种子中表达。在饲料中添加这种转基因烟草的种子便可达到良好的效果。转基因烟草生产植酸酶利用植物生物反应器生产工业原料油菜通常产生十八碳的不饱和脂肪酸，但只要在其体内表达另一个特殊的基因即可使转基因油菜改为 合成月桂酸，并可使其含量提高到44%。此外，鉴于油菜植物易生长且产量高的特点，人们还致力于用它来生产其它工业用油，如可作润滑油和尼龙生产原料 的芥酸以及用于麦淇淋制作的6-十八碳烯酸等。 转基因油菜生产月桂酸利用植物生物反应器生产工业原料聚-b-羟基烷酸（PHAs）和聚羟基丁酸（PHB）两种结构相似的多聚体具有热塑性好、可被微生物完全分解的特性，因此被认为是最好的无污染性塑料原料。转基因拟南芥生产聚羟基丁酸将真核细菌养产碱菌的PHB生物合成基因导入拟南芥中，转基因植物在整个生命周期中，PHB的含量逐步增加，并达到每克湿重植物产10毫克PHB的最大产量，大约相当于细胞干重的14%。2、 植物转基因技术在植物品种改良中的应用控制果实成熟的转基因植物抗病虫害的转基因植物抗除草剂的转基因植物改变花卉形状和颜色的转基因植物抗环境压力的转基因植物改善品质的转基因植物控制果实成熟的转基因植物植物细胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶ACC和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。科学家采用反义RNA技术封闭番茄细胞中上述两个酶编码基因的表达，由此构建出的重组番茄的乙烯合成 量分别仅为野生植物的3%和0.5%，明显增长了番茄的保存期。控制果实成熟的转基因植物植物体内乙烯的生物合成机制抗病虫害的转基因植物将抗虫基因导入农作物是植物基因工程的得意之笔，能避免化学杀虫剂所造成的许多负面影响。目前 ，抗虫作物已占全球转基因作物的22。用于构建抗虫害转基因植物常见的外源基因有苏云金芽孢杆菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、 几丁质酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多个，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因和凝集素基因应用最为广泛。 细菌毒素蛋白编码基因的植物转基因程序水稻抗虫基因

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