高效液相色谱仪器讲稿
5页1、1液相色谱根据目前市场情况主要分进口和国产两大类,进口主要有美国产 Waters(实验室存有 Waters1525 价格:35.6W ) 、安捷伦(实验室存有 Aglient1200 价格 34.5W) 、塞尔泰、戴安、日本岛津等系列;国产有大连依利特、大连江申、上海上分、上海伍丰、浙江温岭、北京温分等系列。液相色谱仪结构主要由贮液器、高压输液泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。1贮液器:使用四元泵时(Aglient1200) ,A 、B、C、D 四相中,若所用流动相中有含盐流动相,则 A、D(进液口位于混合器下方)放置含盐流动相, B、C(进液口位于混合器上方)放置不含盐流动相;A 、B、C、D 四个储液器中其中一个为棕色瓶,用于存放水相流动相。在最后通常还有一个废液瓶。使用二元泵时(Waters1525) ,B 相位于下方,通常放置盐溶液,A 相位于上方,放置有机溶剂,可使用普通玻璃溶剂瓶贮存流动相。附流动相使用注意事项:1) 流动相的纯度要求:有机溶剂必须是色谱纯,水必须是超纯水且现从纯水机中取出不能过夜,缓冲溶液需现取超纯水配置,并经过 0.45um 滤膜(注意
2、水相膜与油相膜不能混用)过滤除去其中的颗粒杂质和其它物质。任何流动相使用前都要经超声脱气,脱气后恢复到室温才使用。流动相使用不当引起的问题:流动相不纯会增加检测器噪声从而影响检测结果,长期积累会堵塞柱子;脱气不彻底有气泡会导致压力不稳,重现性差。2) 流动相与固定相不能相互作用,否则造成柱效降低甚至损坏色谱柱。3) 样品必须溶于流动相,否则会堵塞柱子。4) 使用紫外检测器时,流动相不应有紫外吸收。2高压输液泵流动相由高压泵输送和控制流量。泵由入口单向阀、出口单向阀、柱塞杆、密封圈等组成,是液相色谱仪的重要组成部分,是导致 HPLC 的高压、高速、高效特点的主要部件。1)使用前先进行排气 purge。Waters1525 :先用针筒从上下两个泵口的排液阀分别各抽取约 5 mL 流动相,再打开参比阀(向右搬) ,点击 purge 图标,冲洗泵 5 min(一般是默认 5 min,之后仪器自己停泵) ,待停泵后,压力和流速都降至 0 后,才能关上参比阀(向左搬紧) 。Aglient1200:逆时针松开参比阀,通过软件设置流速,从 0 上升至 5mL/min,保持至少 10min。2) 若使用
3、缓冲液,工作结束后需用超纯水清洗泵中残留的缓冲液。3) 不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中。 3进样器:通常采用高压六通阀进样装置。手动进样:1) 进样图标出现2) 进样阀“Load”装样3) 针先排汽泡。4) 进样5) 搬 injected 计时约 10s,否则会倒流6) 图标消失,拔针7) 洗针(用溶剂洗)4色谱柱使用注意事项:1) 柱子使用 pH 范围。C18 反相柱一般适用的样品 pH 范围在 28,故一定要精确调节好缓冲液的 pH 值和样品的 pH 值,并注意缓冲液的浓度不得超过 0.02mol/L。2) 柱子使用压力范围。正常状况下流速会逐步上升,柱压也随之逐步上升直至维持较稳2定的范围,最高压力不超过 4000Psi,注意结合每根柱子的使用说明,每天都要记录柱压。3) 柱子使用流速范围。根据不同色谱柱设定相应的流速。4) 柱子方向不能接反(否则会冲坏固定相) 。5) 使用缓冲液时,做完样品后应立即用超纯水冲洗管路及柱子 1 小时,然后用甲醇冲洗40 分钟以上,以确保整个管路及柱子保存于有机溶剂中。6) 长时间不用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存,注意不能用纯水保存柱子,而应该用
4、有机相(如甲醇等) ,因为纯水易长霉。5柱温箱:控制温度,Waters1525 一般设置柱温 3040,高于室温 5,但必须打开示差检测器;Aglient1200 可设低于室温 10,最高可设定 80。6检测器:UV 检测器是 HPLC 中应用最广泛的检测器,当检测波长范围包括可见光时,又称为紫外 -可见检测器。它灵敏度高,噪音低,线性范围宽,对流速和温度均不敏感,但是梯度洗脱时,还会产生漂移。紫外检测器一般针对有紫外吸收的样品的检测,其波长设置在样品的最大吸收波长处。开机操作附 1:Waters-1525 液相色谱仪操作详细规程1、 使用人提前一周于精密仪器室进行预约2、 登记仪器使用记录,擦拭桌面灰尘,检查废液瓶(有残留的话,及时先倒至卫生间) 。3、 打开柱温箱检查是否为所要使用的柱子(换柱子要注意流动方向) ,然后依次打开柱温箱、1525 泵,2487 紫外检测器和 2414 示差检测器,等待 8 min,以便进行内部校正和诊断测试,检测器需要预热 20 min。注意纯水机的蒸馏水每天更新一次。4、 准备好自己所需的流动相,并用超声波清洗器脱气 30 min。5、 换上已脱气流
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