高效液相色谱仪器讲稿

1液相色谱根据目前市场情况主要分进口和国产两大类，进口主要有美国产 Waters（实验室存有 Waters1525 价格：35.6W ） 、安捷伦（实验室存有 Aglient1200 价格 34.5W） 、塞尔泰、戴安、日本岛津等系列；国产有大连依利特、大连江申、上海上分、上海伍丰、浙江温岭、北京温分等系列。液相色谱仪结构主要由贮液器、高压输液泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。1贮液器：使用四元泵时（Aglient1200） ，A 、B、C、D 四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则 A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相， B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；A 、B、C、D 四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。在最后通常还有一个废液瓶。使用二元泵时（Waters1525） ，B 相位于下方，通常放置盐溶液，A 相位于上方，放置有机溶剂，可使用普通玻璃溶剂瓶贮存流动相。附流动相使用注意事项：1） 流动相的纯度要求：有机溶剂必须是色谱纯，水必须是超纯水且现从纯水机中取出不能过夜，缓冲溶液需现取超纯水配置，并经过 0.45um 滤膜（注意水相膜与油相膜不能混用）过滤除去其中的颗粒杂质和其它物质。任何流动相使用前都要经超声脱气，脱气后恢复到室温才使用。流动相使用不当引起的问题：流动相不纯会增加检测器噪声从而影响检测结果，长期积累会堵塞柱子；脱气不彻底有气泡会导致压力不稳，重现性差。2） 流动相与固定相不能相互作用，否则造成柱效降低甚至损坏色谱柱。3） 样品必须溶于流动相，否则会堵塞柱子。4） 使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2高压输液泵流动相由高压泵输送和控制流量。泵由入口单向阀、出口单向阀、柱塞杆、密封圈等组成，是液相色谱仪的重要组成部分，是导致 HPLC 的高压、高速、高效特点的主要部件。1）使用前先进行排气 purge。Waters1525 ：先用针筒从上下两个泵口的排液阀分别各抽取约 5 mL 流动相，再打开参比阀（向右搬） ，点击 purge 图标，冲洗泵 5 min（一般是默认 5 min，之后仪器自己停泵） ，待停泵后，压力和流速都降至 0 后，才能关上参比阀（向左搬紧） 。Aglient1200：逆时针松开参比阀，通过软件设置流速，从 0 上升至 5mL/min，保持至少 10min。2） 若使用缓冲液，工作结束后需用超纯水清洗泵中残留的缓冲液。3） 不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中。 3进样器：通常采用高压六通阀进样装置。手动进样：1） 进样图标出现2） 进样阀“Load”装样3） 针先排汽泡。4） 进样5） 搬 injected 计时约 10s，否则会倒流6） 图标消失，拔针7） 洗针（用溶剂洗）4色谱柱使用注意事项：1） 柱子使用 pH 范围。C18 反相柱一般适用的样品 pH 范围在 28，故一定要精确调节好缓冲液的 pH 值和样品的 pH 值，并注意缓冲液的浓度不得超过 0.02mol/L。2） 柱子使用压力范围。正常状况下流速会逐步上升，柱压也随之逐步上升直至维持较稳2定的范围，最高压力不超过 4000Psi，注意结合每根柱子的使用说明，每天都要记录柱压。3） 柱子使用流速范围。根据不同色谱柱设定相应的流速。4） 柱子方向不能接反（否则会冲坏固定相） 。5） 使用缓冲液时，做完样品后应立即用超纯水冲洗管路及柱子 1 小时，然后用甲醇冲洗40 分钟以上，以确保整个管路及柱子保存于有机溶剂中。6） 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如甲醇等） ，因为纯水易长霉。5柱温箱:控制温度，Waters1525 一般设置柱温 3040，高于室温 5，但必须打开示差检测器；Aglient1200 可设低于室温 10，最高可设定 80。6检测器：UV 检测器是 HPLC 中应用最广泛的检测器，当检测波长范围包括可见光时，又称为紫外 -可见检测器。它灵敏度高，噪音低，线性范围宽，对流速和温度均不敏感，但是梯度洗脱时，还会产生漂移。紫外检测器一般针对有紫外吸收的样品的检测，其波长设置在样品的最大吸收波长处。开机操作附 1：Waters-1525 液相色谱仪操作详细规程1、 使用人提前一周于精密仪器室进行预约2、 登记仪器使用记录，擦拭桌面灰尘，检查废液瓶（有残留的话，及时先倒至卫生间） 。3、 打开柱温箱检查是否为所要使用的柱子（换柱子要注意流动方向） ，然后依次打开柱温箱、1525 泵，2487 紫外检测器和 2414 示差检测器，等待 8 min，以便进行内部校正和诊断测试，检测器需要预热 20 min。注意纯水机的蒸馏水每天更新一次。4、 准备好自己所需的流动相，并用超声波清洗器脱气 30 min。5、 换上已脱气流动相，启动电脑，连接 Breeze 软件，左下角蓝色进度条完成即表示联机成功。先用针筒从上下两个泵口的排液阀分别各抽取约 5 mL 流动相，再打开参比阀（向右搬） ，点击 purge 图标，冲洗泵 5 min（一般是默认 5 min，之后仪器自己停泵） ，待停泵后，压力和流速都降至 0 后，才能关上参比阀（向左搬紧） 。6、 点击 Manage Breeze，选择或新建一个 Project/User7、 若方法之前在相应的 Project/User 已保存，则可直接调用出来平衡。8、 新建色谱方法：点击 View Method，点击 Pump 图标，输入柱子最高限压，选择泵的模式（恒流或者梯度洗脱） 、设定流速，流动相比例等；点击 UV Det 图标，在 Channel 1中输入检测波长（若检测双波长则在 Channel 2 中输入另一波长值） ；点击 RI Det 图标，在 Temprtature 中的 External Heater 1 中输入所需要的柱温箱温度，并打勾。9、 平衡时，注意进样阀应处于 Inject 状态，点击平衡图标，选择色谱方法，系统平衡约3060 min，平衡时需注意柱压力，如有异常需及时停泵，查找原因。 （柚皮苷和柚皮素的检测（280nm）平衡至少需要 20min 以上，待两个紫外数值差值至少有 5 个零方可进样）10、平衡完成后，将进样阀搬回 Load 状态，点击 Inject 图标，更改样品名称、色谱方法和跑样时间，回车，放入进样针，等出现提示进样的对话框后再进样，进样量应是定量环体积的 4 倍（定量环 20L，进样量 80L） ，每次进样时宜保持相同的打针速度，切记不能将气泡打入，进样完成后，迅速将进样阀搬至 inject 状态，对话框消失后，再拔针，进样针立刻用溶剂清洗至少 5 次（样品溶剂如果是水相，用纯水清洗，有机相则用甲醇清洗） ，进样前如样品量够得话，建议再用样品润洗进样针。311、样品检测结束后，按停泵图标停泵，在紫外检测器面板上按 shift+1 关闭紫外检测器的氘灯（延长灯的寿命） ，然后开始洗柱子，C 18 反相柱用超纯水：甲醇（95：5 已脱气）冲洗 40 min（流速从 0.5 mL/min 慢慢加至 1.0mL/min，增加流速过程需注意压力变化，不能超过限压，Symmetry 型号的最好不能超过 3000 PSI） 。在此过程需另外超声一瓶色谱纯的甲醇。下一步清洗将超纯水换成甲醇（已脱气） ，然后用甲醇：甲醇（50：50）冲洗 40 min（流速调节同第一步的清洗过程） 。12、柱子洗好后，停泵，待压力降至 0 后，打开参比阀，先用超纯水再用甲醇清洗进样口、进样针、泵孔，切记不能将空气打入进样口（至少 5 个注射器体积） 。13、先关闭 Breeze 软件和电脑，再关柱温箱、泵、检测器，不必关闭 UPS（断电保护器） 。14、关机完成后，将仪器盖好防尘罩，整理实验台面，倒废液（两个都要倒干净，倒卫生间） ，关空调，关好门窗，并对仪器使用情况和仪器状态如实进行登记。注意事项：1. 如遇停电，UPS 能维持半小时，应立刻停止测样，停泵，再换超纯水：甲醇（95：5 已脱气）洗柱子 30 min。2. 正常状况下流速会逐步上升，柱压也随之逐步上升直至维持较稳定的范围，最高压力不超过 4000Psi，注意结合每根柱子的使用说明，每天都要记录柱压。3. 更换柱子时应先让柱前的管路通过流动相 5min 左右，然后再接上柱子，注意柱子的方向，并时刻观察压力。4. C18 反相柱一般适用的样品 pH 范围在 28，故一定要精确调节好缓冲液的 pH 值和样品的 pH 值，并注意缓冲液的浓度不得超过 0.02mol/L。5. 柱温箱一般设置在 3040，高于室温 5，使用柱温箱一定要打开示差检测器。6. 使用示差检测器，每更换一个条件就必须先 purge 示差检测器参比池 10 h，流动相要混合在一个瓶子脱气。7. 从反相柱换至正相柱的步骤：甲醇 异丙醇（0.2 mL/min 冲洗 10 h） 正己烷（1.0 mL/min 冲洗 4 h） 。8. 不能对色谱方法，通道，数据等做删除处理。9. 防止流动相流完，过滤头一定要浸没在流动相中。10. 实验结束后确定整个仪器、色谱柱都保存在有机相中。11. 缓冲液或超纯水必须每天更换新的，使用缓冲液要先用超纯水：甲醇（95：5 已脱气）过渡 20 min。缓冲液要过 0.45m 的滤膜。12. 一般情况下，Breeze 软件操作界面出现 3 个选项按 NO，2 个选项按 YES，保存图谱时除外。13. 样品要事先处理好，保证样品澄清，需要过膜的，都必须严格用 0.45m 滤膜过滤（注意区别水相用膜和有机相用膜） ；保证样品 pH 落在使用柱的 pH 范围内。使用Eppendorf 高速离心机时候，要注意对称平衡放好，离心管如有破裂应及时将离心机通道内残留的液体吸干。14. 实验室严禁烟火，仪器由专人管理，使用仪器者必须进行操作培训和考核，并获负责人批准后，方可上机进行操作。15. 仪器需防震动、防灰尘，废液倒卫生间，实验中人不能离开。附 2：Agilent 液相色谱仪操作规程样品与流动相要求： 1.样品临用前用 0.45um 滤膜过滤（区别水相膜与有机相膜） ，或者临用前离心取上清液4（转速 1 万，20 分钟)2.缓冲溶液必须当天配制，每次使用前用 0.45um 的水相膜过滤，水要求使用当天的超纯水，甲醇或乙腈等有机溶剂要求使用色谱纯。流动相临用前超声脱气 20 分钟液相开机操作过程： 1 首先要启动电脑，进入 Windows 后, 电脑在后台自动运行 Agilent bootp Service。 2 从上往下打开液相色谱仪各模块前左下方的电源开关，液相各模块进入自检，右上角的指示灯不同颜色闪烁几下，最后变成橘黄色(或灭掉 ALS、RID) ，启动完成。 3. 双击电脑桌面的 Instrument 1 联机 图标，进入 LC 化学工作站（方法与运行控制界面） 。4. 调用或者编辑相应的操作方法。 液相关机操作过程： 1. 根据具体情况，使用水或溶剂，泵流量设为 1.0ml/min,把系统的管道及柱子清洗干净。 2. 根据具体情况，不定时把 A、B、C、D 通道用有机溶剂冲洗干净，防止生长藻类等。 3. 把系统关闭(即把泵停下来及检测器的灯灭掉等 )，若有 seal wash,把其清洗的水卡住。 4. 先退出 LC 化学工作站，从下往上关掉液相色谱仪各模块前左下方的电源开关。 5. 退出电脑 Windows 系统，关掉电脑电源。 液相的数据采集操作过程： 1 从化学工作站菜单的方法中编辑完整方法，或者调用方法, 一般是方法存在如D:CHEM321METHODS_.M，即运行此方法。 2 从化学工作站菜单的仪器的启动系统 ,可点击桌面上的启动按纽，也可以点每一模块图标中的控制来开或关。(若有手动 Seal Wash 应先把打开，约每分钟 20 滴) 3. 手