游离核糖体上合成的蛋白质的归宿

1、在细胞质溶质核糖体上合成的多肽，除部分贮留在细胞质中外，多数最终要被运送到靶细胞器中，它们在很大的程度上决定了细胞器的结构与功能。 由于细胞器种类不同，相应蛋白质到靶细胞器的定位过程也不尽相同。但它们的转运机理与内质网膜上合成的蛋白质的转运基本相同，都须要有肽链信号序列的引导。,五、游离核糖体上合成的蛋白质的归宿,第六节 蛋白质的细胞定位,胞质中合成的一些多肽经核孔复合体进入细胞核要依赖于蛋白质本身所携带的核输入信号(nuclear import signal)，此信号是蛋白质入核所必需的关键序列。,（一）核定位蛋白的入核转运,核输入信号是由48个氨基酸构成的一个短肽，富含Lys、Arg和Pro等带正电的氨基酸。,第六节 蛋白质的细胞定位,它与信号肽不同的是： 可以定位在亲核蛋白的不同部位，不仅仅位于N-末端； 进入核后也不被切除（成为蛋白质的永久构成部分）。,核定位蛋白的核输入机制 在细胞质中，游离输入蛋白与运载蛋白的NLS结合，形成运载复合物。在FG核孔蛋白作用下，将核蛋白运入核内。输入蛋白RanGTP经核孔通道返回细胞质,（二）线粒体蛋白质的跨膜运送,这些蛋白质的合成和输入细胞器

2、大体上要涉及到4个步骤：,(1)在细胞质溶质中合成多肽前体物； (2)前体物和细胞器表面的受体结合； (3)穿过并移进细胞器膜； (4)前体物被加工成成熟多肽。,有些蛋白质进入细胞器的跨膜运动也是利用信号机制。,第六节 蛋白质的细胞定位,由胞质溶质运送到线粒体或叶绿体的蛋白质，输入前是以前体蛋白的形式存在。 前体蛋白在氨基端有一段信号序列(signal sequence)。各种信号序列的长短不等，约为20-80个氨基酸残基，在线粒体蛋白质的跨膜转运中起着关键作用。,1. 线粒体蛋白的跨膜运动,（1）线粒体蛋白的前导序列及其受体,第六节 蛋白质的细胞定位, 含有较为丰富的带正电荷的碱性氨基酸(特别是精氨酸)，穿插在不带电荷的氨基酸序列之间，对牵引蛋白质跨膜具有重要作用 ； 不含或基本不含带负电荷的酸性氨基酸； 序列中羟基氨基酸(尤其是丝氨酸)的含量较高； 整个前导序列可形成既具亲水性又具疏水性的两性(amphipathic)-螺旋，这样，可凭藉外正内负的膜电位，使前导肽及其所牵引的蛋白质得以顺利过膜。,线粒体前导序列的特点是：,第六节 蛋白质的细胞定位,线粒体蛋白质特有的导肽序列 (a)

3、 导肽的线性序列；(b) 导肽的折叠后的氨基酸残基的分布图,第六节 蛋白质的细胞定位,线粒体蛋白质前导序列跨膜运送时，首先被其外膜上的受体蛋白识别并相互结合，在电化学梯度势能的驱动下跨过内、外膜的接触点(membrane contact site)，尔后靠ATP水解能进一步进入线粒体基质。,第六节 蛋白质的细胞定位,蛋白质输入线粒体基质示意图,跨越线粒体双层膜的蛋白质还需进一步分别定位于内膜、外膜和膜间隙。 线粒体前导序列的不同部位在蛋白质的跨膜运输过程中发挥着不同的作用。 也就是说前导肽不仅能引导其所在蛋白质进入线粒体，而且还含有指导蛋白质到达细胞器中一些的空间结构部位的不同导向信息。,（2）线粒体跨膜蛋白的分拣定位,第六节 蛋白质的细胞定位,输入蛋白在输入之前，首先要与伴侣蛋白Hsc70结合，而去折叠。线粒体外膜中有输入受体蛋白(如TOM20和TOM22)，可识别基质定位序列，并与之结合，将前体蛋白送入外膜通道(由TOM40构成)。,1、线粒体基质蛋白的输入,定位于基质中的蛋白质还要再通过内膜通道(由TIM23和TIM17)进入基质，在此部位外膜和内膜紧贴在一起。,transloc

4、on of the outer membrane, TOM,translocon of the inner membrane, TIM,import receptor,定位序列在基质中被蛋白酶切除。在内膜转移通道处有基质Hsc70陪伴蛋白，该蛋白与TIM44接触水解ATP，驱动基质前体蛋白转运到基质中。多肽链在伴侣蛋白作用下折叠和装配成三维和四维结构。,TOM20/22,线粒体内、外膜接触部位电镜图,一次性穿膜蛋白 二次穿膜蛋白 多次穿膜蛋白,2、线粒体内膜蛋白的输入,一次性穿膜蛋白 如细胞色素氧化酶的CoxVa亚基，其前体蛋白的N末端含有基质定位序列，此序列可被TOM20/22输入受体识别，通过外膜的通用输入孔和内膜的TIM23/17转移复合物输入到基质中。输入过程中，基质定位序列被切除。CoxVa含有一个疏水性停止转移序列(stop-transfer sequence)，当蛋白质穿过TIM23/17通道时，停止转移序列阻止C-端穿过内膜，然后肽链转移到脂双层中。,二次穿膜蛋白 肽链含有基质定位序列和2段内部疏水区(Oxl 1定位序列)，肽链进入基质后，基质定位区被切除。Oxl 1疏

5、水区被内膜中的Oxa 1蛋白所识别，并将蛋白质插入脂双层中。,多次穿膜蛋白 这类蛋白质N末端没有基质定位序列，而肽链内部含有多个定位序列。如ADP/ATP对向转运体(antiporter)，此蛋白含有6个穿膜区为定位序列，外膜中的TOM70可识别内部定位序列。通过外膜的通用运输孔穿过外膜，在膜间隙中的TIM9/10的协助下，蛋白质被移送到内膜中的转移复合体(由TIM22/54组成)，负责将输入蛋白的疏水性定位序列移入内膜脂双层中。,此类蛋白质前体中在N末端基质定位序列之后，接着为一段长的疏水性氨基酸片段(一个停止转移信号)，可阻止蛋白质进入基质，同时可使蛋白质结合到外膜中，成为外膜整合蛋白。此途径中，蛋白质输入后，其基质定位序列和内部疏水性序列均不切除。,3、外膜蛋白质的输入,4、膜间隙蛋白质的输入, 主要途径, 穿外膜直接途径,穿外膜直接途径 输入蛋白质通过外膜的TOM40通用输入孔，直接将蛋白质释放到膜间隙中，不涉及到内膜，与内膜转移因子无关。例如细胞色素c血红素裂合酶(负责血红素与细胞色素c共价结合)，是一种线粒体膜间隙蛋白。,主要途径 前体物肽链中含有两个不同的N末端定位序列。

6、例如细胞色素 b2，进入基质后，N末端第一个序列被基质中的蛋白酶切除。第二个序列阻止肽链完全穿过内膜，前体物变成内膜TIM23/17通道中的中间物。中间物侧向扩散，离开TIM23/17通道。内膜中的蛋白酶切除穿膜的疏水性片段，将成熟的蛋白质以可溶性形式释放到膜间隙中。,线粒体输入蛋白定位序列的排列形式 大多数线粒体蛋白含有N末端基质定位序列，但各种蛋白质的不相同。,在细胞质溶质中合成的线粒体蛋白质并不都是通过前述途径来运送的。,定位于线粒体外膜的蛋白质就有时就无前导序列，它不以前体形式运送插入。 而细胞色素c可能是直接扩散通过外膜而进入线粒体，再在细胞色素c-血红素裂合酶催化下，加上血红素后成为成熟型并定位于内膜外侧。,第六节 蛋白质的细胞定位,线粒体蛋白质的跨膜运送是一个多步骤的耗能过程，有多种蛋白质参与。,除前导序列可驱动蛋白质前体跨越内外膜并定位于各最终场所外，分子伴侣对于蛋白质跨膜前的解折叠和跨膜后的重新折叠发挥了关链作用。,第六节 蛋白质的细胞定位,叶绿体蛋白质的跨膜运送也与线粒体蛋白类似。二者都是翻译后转移，跨膜转运过程都需要能量驱动，都具有两性氨基末端的前导序列，而且在蛋

7、白质进入目的地的过程中被分次切除。,叶绿体蛋白质跨膜运送的特点：,第六节 蛋白质的细胞定位,（三）叶绿体蛋白质的跨膜运送,叶绿体间质(stroma)中与卡尔文循环有关的酶，除了核酮糖1,5二磷酸羧化酶(rubisco)的大亚基是由叶绿体DNA编码、间质核糖体合成外，其小亚基和所有参与卡尔文循环的酶均由核基因编码、在细胞质溶质中合成，然后输入进叶绿体间质中。,1、叶绿体间质蛋白的输入,这些蛋白质都含有间质输入序列(stromal-import sequence)，此序列富含丝氨酸、苏氨酸和疏水性残基，少谷氨酸和天冬氨酸。,核酮糖1,5二磷酸羧化酶小(S)亚基去折叠后进入间质腔，与间质Hsc70分子伴侣暂时结合，N末端输入序列被切除。,质体蓝素和其他一些类囊体腔蛋白质，肽链中含有两个连续的摄取定位序列(uptake-targeting sequence)。第1个是N末端间质输入序列，引导蛋白质前体进入间质。第2个是类囊体定位序列(thylakoid-targeting sequence)，引导蛋白质进入类囊体腔。,2、类囊体腔蛋白的输入,类囊体腔蛋白的输入途径有4条：, 利用与细菌SecA

8、相关蛋白质的途径, SRP依赖途径, 依赖于与线粒体Oxa 1相关蛋白质的途径, pH 途径,这4条途径均与细菌中的蛋白输入途径类似,蛋白质前体进入间质后，输入序列被切除，在叶绿体信号识别颗粒(SRP)结合，类囊体膜上有SRP受体，SRP与SRP受体结合，经Sec转运体(Sec translocon)进入类囊体腔，类囊体定位序列在腔内被切除., SRP依赖途径：,Sec转运体,类囊体腔蛋白质输入的第2条途径是利用与细菌SecA相关的蛋白质，其机制与革氏阳性菌蛋白质穿过内膜的类似。,革氏阳性菌蛋白质翻译后的穿内膜转移 细菌内膜上有由3个亚基组成的转移体通道.,蛋白质定位于类囊体膜，此途径依赖于与线粒体Oxa 1相关的蛋白质。, 第三条途径：,结合金属的类囊体腔蛋白质的输入途径。这些去折叠的蛋白质前体物首先进入间质，在间质中N末端的间质输入序列被切除，随之蛋白质发生折叠，结合上辅因子。一套类囊体膜蛋白和结合的辅因子将折叠蛋白质输入到腔内，这一转移的驱动力来自于pH梯度。, pH 途径：,过氧化物酶体中，无论是膜上还是腔中的蛋白质都是在细胞质溶质中合成后输入的。 绝大多数过氧化物酶体基质蛋白

9、的C末端含有SKL(Ser-Lys-Leu)序列，此序列称为过氧化物酶体定位序列(peroxisomal-targeting sequence, PTS 1)。 当把这一短的信号序列连接到细胞质中的任何蛋白质上，都可使该蛋白质被输入过氧化物酶体中。,(四) 过氧化物酶体中的蛋白质输入,第六节 蛋白质的细胞定位,第六节 蛋白质的细胞定位,在细胞质溶质中，PTS 1与可溶性和膜结合的受体蛋白Pex14结合，在功能上与SRP和SRP受体使定位于ER腔的蛋白质输入机制类似。 输入蛋白结合着Pex5通过多体转移通道。在进入基质过程中或进入基质之后，Pex5与过氧化物酶体蛋白质解离，返回细胞质。但PTS1序列不切除。蛋白质输入过程需要水解ATP。,过氧化物酶体基质蛋白由PTS1定位序列引导输入,第1步：过氧化氢酶和其他大多数基质蛋白C末端均含有PTS1摄取定位序列，此序列与细胞质溶质受体Pex5结合。,第2步：结合了基质蛋白的Pex5与过氧化物酶体膜上的Pex14相互作用。,第3步: 基质蛋白-Pex5复合物被转移到一组膜蛋白(Pex10/Pex12/Pex2)上，基质蛋白被输入到过氧化物酶体基质中。,第4步：在基质蛋白转移过程中或在腔内，Pex5与基质蛋白解离，返回细胞质溶质中，返回过程中还要涉及到Pex10/Pex12/Pex2复合物和另外一些膜蛋白及细胞质溶质蛋白质。,输入蛋白质可以折叠状态进入过氧化物酶体，输入后定位序列不切除.,第六节 蛋白质的细胞定位,输入过氧化物酶体的蛋白质是以折叠状态穿膜，在穿膜之前即以折叠构象结合血红素。根据推测，装配的转移通道孔径可大小不同，以准确适合不同大小的PTS1携带的分子穿膜。,人类Zellweger综合征(Zellweger syndrome)即是由于过氧化物酶体中缺乏输入蛋白，导致该细胞器产生缺陷。病人细胞内含有“空的”过氧化物酶体，脑、肝、肾严重异常，出生后很快死亡。,小结,蛋白质,信号肽,核输入信号,线粒体 定位信号,微体 定位信号,微体,叶绿体,线粒体,溶酶体,Golgi 复合体,内质网,细胞核,细胞质溶质 蛋白,中心体,KDEL,M6P,细胞质溶质中的 游离核糖体库,动物细胞内所合成蛋白质的定位,叶绿体 定位信号,细胞质溶质途径,糙面内质网途径,分泌蛋白,膜蛋

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