精编制作聚合酶链式反应-2014PPT课件
108页1、第三章聚合酶链式反应 polymerasechainreaction PCR 王晓华 聚合酶链反应 又称体外DNA扩增技术 是利用耐热DNA聚合酶的反复作用 通过变性 退火 延伸循环操作 在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术 它能快速将皮克 pg 水平的DNA特异地扩增100万倍左右 达到微克 g 水平 优点 敏感度高 特异性强 产率高 重复性好以及快速简便等 在分子生物学 基因工程研究 以及遗传病 传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用 并已普及到许多普通实验室 大大简化了传统的分子克隆技术 便于对目的基因进行分析 鉴定 目的基因 载体 复制子 宿主细胞 扩增 扩增 提取DNA分子 通常的DNA扩增法是分子克隆法 首先要构建含有目的的基因的载体 然后将它导入细胞后进行扩增 还要用同位素探针等方法进行筛选 经过DNA内切 连接 转化和培养等相关的过程 操作复杂 一般需要数周时间 70年代的初期由Dr H Klenow发现了较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE Coli 1976年从温泉中的细菌 Thermusaquaticus 分离出来的Taqpo
2、lymerase 它的特性能耐高温 80年代之后它被广泛运用 1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法 1985年美国PE Cetus公司开发出了具有应用价值的PCR技术 1987年引入了耐高温的DNA聚合酶 从而使PCR成为一项成熟的技术 而迅速在世界各地推广 1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖 PCR技术的发现 KaryBMullis 1944 1983年提出PCR方法1993年度诺贝尔化学奖 一 PCR基本原理 PCR是一项DNA体外合成技术 类似于生物体内的DNA复制过程 依据DNA半保留复制的机理 PCR合成DNA比细胞内复制过程简单 第一节PCR技术的原理和特点 细胞内复制的过程 1 细胞内有关蛋白质参与下 DNA双螺旋解链成两条单链 各自作为模板 2 引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物 引物提供3 OH末端 3 DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板 以dNTP为原料 按照碱基配对的原则 从引物的3 端 循5 3 方向 将脱氧核苷酸聚合 最终形成子代的DNA双链 Denaturing95 C AnnealingTm 5 C Extension72
3、C PCR的原理 PCR的基本过程 1 变性 将反应体系升温至95 左右 样品中双链DNA解开成两条单链 各自作为模板 待拷贝的DNA称为模板 2 退火 将温度降至引物的Tm值以下 55 左右 5 端和3 端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合 3 延伸 将温度升到75 左右 耐热的TaqDNA聚合酶催化四种dNTP 从引物3 OH端开始 依据模板碱基序列互补方式依次聚合 合成一条互补的DNA链 5 5 3 3 5 DNA聚合酶 5 PCR的扩增效应 理论上 每增加1个循环 双链DNA片段会增加1倍 使DNA量可成指数 2n 增加 实际上 扩增效应低于指数增加 约为 1 X n 一般进行30个左右的循环 特定区域的DNA量可至少增加106倍 PCR产物的积累规律 PCR反应初期 目的DNA片段的增加呈指数扩增 随着目的DNA扩增产物的逐渐积累 酶的催化反应趋于饱和 此时DNA扩增产物的增幅减慢 即出现 平台效应 到达平台期所需要的循环次数一般在30次循环之后 PCR产物的鉴定 提取 PCRDNA复制部位 DNA体外合成放大过程生物体内DNA合成引物 DNA片段RNA片段 作为新
4、链的一部分 复制终止时被切除 催化酶 TaqDNA聚合酶DNA聚合酶有5 3 核酸外切酶有5 3 核酸外切酶无3 5 核酸外切酶有3 5 核酸外切酶基本过程 每循环一次包括复制起始 链延伸和变性 退火 延伸终止三阶段反应实质 扩增靶DNA合成子代DNA PCR仪 聚合酶链反应中的变性 退火 延伸的温度和时间 以及循环次数 是由具有程控的快速升温和快速降温装置的PCR仪控制 PCR仪 越快 越精确 越昂贵 ABI7500实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 二 PCR技术的特点 1 高度的敏感性 可将极微量 pg DNA 扩增到紫外光可见的水平 ug 这是最主要的特点 PCR产物的生成量以指数方式增加 它可对单拷贝基因 单个细胞 单根头发 一滴血等微量标本进行分析 2 高度的特异性 PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定 因此引物设计至关重要 引物与模板DNA特异正确的结合 遵循碱基配对原则 TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性 选择特异性与保守性高的靶基因 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键 引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率和特异性 同时尽可能
5、减少非特异性扩增 基因组 3 适用样品的广泛性 对样品的要求并不十分严格 1 可以是DNA 也可以是RNA2 可以是纯化的 也可以是粗制的3 可以是新鲜组织 也可以是陈旧组织4 可以是细胞 也可以是体液4 操作简便 快速 PCR自动化 数小时完成 扩增产物一般用电泳分析 不一定要用同位素 无放射性污染 易推广 三 参与PCR反应体系的因素及其作用 模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2 缓冲液反应温度循环次数PCR仪等 PCR体系 一 模板 核酸 1 模板 指能扩增靶DNA片段的核酸2 DNA是直接模板 RNA是间接模板 RNA样品必须先经过逆转录生成cDNA cDNA作为PCR扩增的模板 这个技术称为逆转录PCR RT PCR 病原体标本 有病毒 细菌 真菌 螺旋体 立克次体 支原体等 病理生理标本 有细胞 血液 绒毛 羊水细胞 尿液 上皮细胞 体外培养细胞系 法医学标本 有血斑 精斑 毛发等 考古标本 残留有核酸物质 3 常见的扩增对象 含核酸的标本 4 避免有影响扩增反应的物质存在如 核酸酶 降解DNA RAN蛋白酶 降解TaqDNA聚合酶血红素 抗凝剂 抑制TaqDNA聚合酶
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